PINK1与α-synuclein相互作用结构域鉴定

目的: 确定PINK1与α-synuclein相互作用的结构域。方法: 将PINK1不同结构域质粒(pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1^WT, pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(G309D),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(ΔN35),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(ΔC145),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(156~509), pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(Δ156~581), pcDNA3.1-3xFlag-vector)分别和pCMV-Myc-α-synuclein质粒共转染人胚肾HEK293T细胞,通过免疫共沉淀(Co-IP)技术验证PINK1与α-synuclein相互作用的结构域;同时进行免疫细胞化学染色,利用激光扫描共聚焦显微镜观察两种蛋白的共定位关系。结果: Co-IP实验结果表明PINK1与α-synuclein相互作用的结构域为PINK1的激酶结构域。免疫细胞化学实验也证实α-synuclein只与含激酶结构域的PINK1蛋白在细胞中存在共定位关系。结论: PINK1与α-synuclein相互作用的结构域位于其激酶结构域。     

6-羟多巴胺纹状体内注射制作大鼠帕金森病模型的研究

目的 为拓宽6-OHDA损毁多巴胺能神经元所制备大鼠帕金森病模型的应用范围,采用多位点纹状体内注入6-OHDA的途径来制备模型。方法 研究用SD大鼠,两个针道内四点定位注射,每点注射3μg／μ16-OHDA3μl。结果 术后两周出现缓慢旋转,4周旋转行为达到7转／分并保持稳定;形态学染色可见损毁1周后注射侧黑质酪氨酸羟化酶免疫组化阳性细胞减少20％,2周后减少38％,3～4周减少70％以上,6周后损伤趋缓。高效液相-电化学法活体检测纹状体内多巴胺的代谢产物3、4-二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA),发现注射侧和非注射侧相比含量分别下降98．33％和96．05％;组织匀浆检测损毁侧黑质多巴胺含量下降了73％以上,3、4-二羟基苯乙酸(DOPAC)含量下降60％。结论 纹状体内注射6-OHDA能够制备帕金森病大鼠模型。     

过表达PINK1抵抗鱼藤酮引起多巴胺神经元损伤的研究

目的:明确在C57BL/6小鼠纹状体过表达野生型的人源帕金森相关蛋白PINK1能否减轻由侧脑室注射鱼藤酮引起多巴胺神经元损伤。方法:通过向C57BL/6小鼠(雄性,7周龄,18~20g)左侧纹状体中注射带有GFP人源野生型PINK1及突变体PINK1^G309D的慢病毒包装颗粒,两周后向小鼠左侧侧脑室中定位注射鱼藤酮,通过蛋白质印迹,免疫组化和行为学的方法检测PINK1对鱼藤酮引起多巴胺神经元损伤的影响。结果:蛋白质印迹和免疫组化的实验都证明了在C57BL/6小鼠纹状体过表达野生型的PINK1对于鱼藤酮引起多巴胺能神经元的减少有明显的抑制作用(P<0.01),但对鱼藤酮引起的行为学损伤没有明显的改善作用。     

帕金森病发病机制与治疗研究进展

帕金森病(Parkinson's disease PD)是第二大中枢神经退行性疾病,常见于老年人。其最主要的临床表现是静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势不稳等运动症状。典型的病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元进行性变性缺失,残存的多巴胺能神经元胞质内出现病理标志物路易体(lewy's body)。PD的病因和发病机制尚不完全清楚,目前认为PD可能是遗传、环境、老龄化等因素共同作用的结果,具体机制涉及线粒体功能障碍、氧化应激、神经炎症、兴奋性毒性损伤等。由于病因不清、发病机制复杂导致PD的治疗依旧是一个亟待解决的问题,目前已有的治疗手段包括药物治疗、外科手术治疗、细胞和组织移植治疗、基因治疗等,但均存在不同程度的弊端。本文主要结合近年来文献研究进展,对PD发病机制及其治疗现状进行概述,旨在为PD基础研究及药物研发提供一定线索。     

α-突触核蛋白对线粒体膜造成孔道样损伤

α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn）作为第一个发现的帕金森病（Parkinson’s disease, PD）致病基因,在PD发生发展过程中具有重要作用。尽管有研究发现,α-syn对线粒体功能有损伤作用,但其对线粒体膜的损害机制尚不明确。本实验旨在探究α-syn对线粒体膜形态的影响,并找到更加微观的方式观察线粒体膜的变化。Thy-1-α-syn转基因动物与野生型动物相比,线粒体膜电势降低17%（P<0.01）,膜通透性增加20.5%（P<0.01）,转基因组线粒体细胞色素C释放增多64%（P＜0.01),这有可能引起线粒体自噬和细胞凋亡。原子力显微镜结果显示,野生型小鼠脑组织线粒体表面光滑,α-syn转基因小鼠脑组织线粒体表面发现有锯齿状改变,而且在过表达α-syn的原代神经元线粒体膜表面有许多小凹陷,出现口径60 ～ 200 nm,深达20 ～ 60 nm的孔道。这可能是α-syn对线粒体膜造成的孔道样损伤。过表达α-syn全长组和N端组的原代神经元电镜结果显示,线粒体膜被破坏,并且出现空泡样线粒体和自噬小泡。本研究发现,过表达α-syn可能在线粒体表面形成孔道样改变,α-syn的N端是引起线粒体膜损伤主要结构域。     

原子力显微镜检测过表达α-突触核蛋白引起的线粒体结构变化

目的：利用原子力显微镜等方法,明确α-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）过表达对线粒体的影响。方法：将腺相关病毒（AAV）载体介导表达的α-syn (AAV /α-syn)病毒包装颗粒,给大鼠脑内黑质区定位注射,建立α-syn过表达的大鼠模型,并以AAV介导表达的报告基因LacZ (AAV/LacZ)为动物对照组。提取大鼠黑质脑组织的线粒体,并通过JC1染色检测线粒体膜电势（ΔΨ）变化和Western Blot检测线粒体中α-syn蛋白量的变化;采用原子力显微镜观测线粒体表面结构的变化。结果：实验组大鼠黑质脑组织过表达α-syn基因,第16周时,Western blot显示线粒体中α-syn蛋白量增加约2倍;JC1染色发现ΔΨ下降;原子力显微镜观测可见线粒体体积增大,线粒体膜表面出现较多孔道样改变。结论：大鼠黑质脑组织过表达α-syn基因,第16周时,可导致α-syn蛋白在线粒体积聚;并可引起线粒体增大、膜形成孔道样改变、ΔΨ下降。     

胰岛素抵抗与帕金森病

帕金森病(PD)是第二大神经退行性疾病,而糖尿病是帕金森病的一个高危因素。胰岛素不仅是一种作用于外周的激素,负责葡萄糖平衡和能量代谢,它也可以通过血脑屏障,影响大脑的许多生命过程,包括调节神经元存活和生长、维持突触稳定性等。越来越多的研究显示,在帕金森病患者和动物模型的脑中出现胰岛素抵抗。胰岛素信号通路的异常引起α-突触核蛋白的聚集、线粒体功能障碍、神经炎症,以及认知功能减退等。这些都是与PD的发病机制紧密相关的。使用胰岛素增敏药物将是一种潜在的,缓解PD神经退行性病变的新策略。     

PARK 基因家族与帕金森病研究进展

帕金森病(Parkinson disease,PD)是一种多见于中老年人的神经系统变性疾病。PD的发病机制尚未完全清楚,绝大多数学者认为遗传缺陷、环境因素、老龄化等多种因素共同作用导致了PD的发生。近年来PD遗传学研究取得了长足的进步,确定了遗传因素在PD发病过程中的重要地位,发现并鉴定了多个与PD相关的基因。本文对相关基因的研究进展作一综述。     

α－synuclein对小剂量鱼藤酮导致的线粒体损伤的调控作用研究

建立稳定表达 -synuclein基因的人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞,,鱼藤酮作用1、2、4周后分别提取各组细胞线粒体,检测其complexⅠ功能、线粒体膜肿胀度和超氧阴离子的含量。结果显示在1、2周时过表达 -synuclein基因的细胞与对照组细胞相比,前者的complexⅠ的活性高,线粒体膜肿胀度轻,线粒体超氧阴离子的含量少。但4周后,前者的complexⅠ活性明显低于后者,且线粒体膜肿胀度及线粒体内超氧阴离子的含量均显示前者高于后者,也是前者多于后者。由此可见过表达 -synuclein基因的细胞在早期对鱼藤酮的损伤有一定的抵抗作用,但长期作用后可能有加重损伤的作用。提示PD患者多巴胺能神经元内 -synuclein的增高可能对小剂量鱼藤酮导致的线粒体损伤存在双重调节作用,初期可能由于 -synuclein上调引起的预适应改变起到一定的保护作用。而失代偿后,可能由于神经元内积累的 -synuclein聚变,对线粒体膜稳定性的损伤,导致神经元变性死亡。