水稻白叶枯病抗性基因Xa23鉴别菌株突变体库的构建及无毒基因突变体的筛选

利用in vivo转座技术构建了白叶枯病抗性基因Xa23鉴别菌株的突变体库,特异性引物PCR扩增和转座子插入位点旁侧序列分析结果表明转座子插入到白叶枯病菌的基因组中。经人工接种鉴定,筛选到4个毒力发生变化的突变体。为进一步克隆Xa23无毒基因提供了条件。     

无选择标记和载体骨干序列的Xa21转基因水稻的获得

利用双右边界T-DNA载体通过根癌农杆菌介导法将水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa21导入杂交稻重要恢复系C418中。T0代共获得27个独立转基因株系,通过田间抗性鉴定与PCR分析,有17个株系的Xa21基因分子鉴定为阳性,且对白叶枯病原菌P6生理小种具有抗性。通过对17个株系的后代植株进行田间抗性鉴定,分子标记辅助选择及Southern杂交分析,结果显示4个株系的T1代植株中能分离出无潮霉素标记基因的Xa21转基因植株。无选择标记Xa21转基因株系的获得率为15%。PCR检测还表明,这些无选择标记的Xa21转基因植株不带有载体骨架序列。通过对转基因后代进一步的抗性鉴定与PCR辅助选择,获得了无选择标记和载体骨架序列的转基因Xa21纯合的抗白叶枯病水稻。     

水稻抗白叶枯病基因Xa4位点跨叠BAC克隆群的构建

水稻白叶枯病抗性基因Xa4已被定位于第11染色体长臂末端的分子标记VG181和L1044之间,并与抗性基因同源序列片段RS13共分离。利用这3个标记筛选IRBB56的BAC文库,共得到128个阳性BAC克隆,其中RS13获得18个阳性克隆,这18个克隆中有4个和6个我隆分别同时为G181和L1044的阳性克隆,选其中的12克隆进行分析,构建了一个从G181到L1044区间的BAC跨叠克隆,全长420kb,并且56M22、106P13和104B153个BAC克隆可覆盖整个跨叠克隆群。这一研究结果为进一步分离Xa4基因打下基础。     

转基因水稻T—DNA侧翼序列的扩增与分析

利用现有的转抗白叶枯病基因Xa21的水稻材料,通过TAIL－PCR技术扩增出携带Xa21基因的T－DNA的侧翼序列,对24个有效扩增片段的序列分析结果表明,其中14个侧翼序列是水稻DNA,9个含载体主干序列,1个是外源基因Xa21片段,14个T－DNA侧翼的水稻DNA序列与直接转化法外源基因整合位点的基因组序列具有不同的特点,这些T－DNA在水稻染色体上整合后其两端序列的特点类似于在转基因双子叶植物中观察到的现象,在含主干序列的侧翼序列（37．5％,9／24）,中,载体主干序列是以不同的类型出现的。     

水稻NBS-LRR类R基因同源序列

根据多数抗病基因(R)编码蛋白质的核苷酸结合区(nucleotide binding site, NBS)和富含亮氨酸重复(leucine-rich repeat,LRR)保守区域特点,设计PCR特异扩增引物,从水稻中克隆了大小约为520 bpDNA片段23个.通过序列同源比较分析发现, 它们编码的蛋白质氨基酸序列包括有NBS-LRR类基因所具有的kinase-1a,kinase-2a, kinase-3a和保守的domain 2区域,它们属于R基因同源序列(R gene homologous sequence, 简称RS).聚类结果发现它们分为4类.遗传定位结果表明它们分布在1,3,4,7~11染色体上,其中10个RS位于已知R基因所在的染色体区间.用水稻抗白叶枯病基因Xa4的近等基因系和基因累加系对克隆的NBS-LRR同源序列进行RFLP分析,发现序列RS13可能来自Xa4基因家族.     

龙葵抗阿特拉津生物型叶绿体基因文库的建立

用对阿特拉津(Atrazine)除草剂抗性的龙葵生物型B_(12)株系作材料,制备叶绿体DNA。B_(12)株ctDNA(叶绿体DNA)经BamHI酶解,在0.7％琼脂糖凝胶电泳上呈现24条带,其中最大的片段为18.6kb,最小的片段为1kb。用pBR322作为载体,构建B_(12)株ctDNA BamHI片段文库。通过与探针的分子杂交,从中筛选出含有编码叶绿体32kd蛋白质的阿特拉津抗性基因的克隆pSB135和含有ATP合酶α亚单位基因的克隆pSB132。     

由农杆菌介导将白叶枯病抗性基因Xa21转入我国的5个水稻品种

利用农杆菌介导的转化系统将已克隆的Xa21基因转入我国5个水稻主栽品种, 获得了110个独立的转基因系. 转基因植株的PCR和Southern分析揭示Xa21基因已整合到受体基因组. 已整合的Xa21基因能稳定遗传, 单拷贝整合的转化体在自交T1代呈现抗感3:1的分离. 接种实验表明转基因T0植株和Xa21-PCR阳性T1植株对白叶枯病的高度抗性. 经过筛选的Xa21纯合的具有优良品质的抗性转基因系可以作为品种直接种植, 或者用于杂交稻育种.     

水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa21导入两用不育系培矮64S

以克隆的Xa21基因为外源基因,成熟胚愈伤组织为转化受体,应用农杆菌介导法对水稻两用型核不育系培矮64S进行转化,获46株转基因植株。PCR和Southern分析结果表明,Xa21已整合到受体基因组。用稻白叶枯病病原菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)菲律宾小种6号接种鉴定,结果表明大多数转基因植株获得了抗病性。已整合的Xa21基因能够稳定地遗传,在所检测转基因株系的T1代中,Xa21基因显示3:1的分离。     

水稻第六染色体长臂亚端粒区遗传图与物理图的整合

生物染色体亚闰区域在物种翰经过程中是高度活跃的。为了认识水稻染色体亚端粒区域的组织结构,用水稻第六染色体长臂亚端料区的ＲＦＬＰ标记Ｇ３４２和Ｒ１１６７作探针筛选ＢＡＣ文库,以得到的阳笥ＢＡＣ克隆为起点进行染色体眇地,构建了覆盖这２个分子标记区约５００ｋｂ的ＢＡＣ跨叠克隆群,将这一区域的跗图和物理图进行了整合。对１４个ＢＡＣ克隆插入末端进行了亚克隆,鉴定的７个亚克隆 端为单考贝或抵考贝序列,其中５个     

Introduction of a rice blight resistance gene,Xa21, into five Chinese rice varieties through anAgrobacterium-mediated system

A cloned gene, Xa21 was transferred into five widely-used Chinese rice varieties through an Agrobacterium-mediated system, and over 110 independent transgenic lines were obtained. PCR and Southern analysis of transgenic plants revealed the integration of the whole Xa21 gene into the host genomes. The integrated Xa21 gene was stably inherited, and segregated in a 3 : 1 ratio in the selfed T1 generation when one copy of the gene was integrated in the transfor-mants. Inoculation tests displayed that transgenic T0 plants and Xa21 PCR-positive T1 plants were highly resistant to bacterial blight disease. The selected Xa21 homozygous resistant transgenic lines with desirable qualities may be propagated as new varieties or utilized in hybrid rice breeding.