RNAi靶向VP2基因抑制中蜂囊状幼虫病毒在中华蜜蜂幼虫体内复制研究

中蜂囊状幼虫病(Chinese sacbrood disease,CSBD)是造成中华蜜蜂患病死亡的主要原因之一,目前尚无有效的治疗方法。为了研究靶向中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)结构蛋白VP2基因的siRNA介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)作用和其对CSBV在中华蜜蜂幼虫体内复制的影响,设计合成针对CSBV VP2基因的特异性siRNA,以100 nM的浓度与pEGFPN1-VP2-CSBV融合表达载体共同转染至293T细胞中,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和分析siRNA在体外对CSBV VP2基因表达的干扰效果。同时,将siRNA(1μg/μL)和1×10~7拷贝数的CSBV共同饲喂2日龄中华蜜蜂幼虫,检测幼虫体内CSBV拷贝数和幼虫存活率,研究siR-NA对中华蜜蜂幼虫体内CSBV复制的影响。荧光结果显示,在293T细胞中siRNA能抑制CSBV VP2蛋白的表达,并且通过流式细胞仪检测分析发现干扰效果接近40%。幼虫饲喂实验表明,饲喂siRNA组在各时间点幼虫体内CSBV拷贝数均低于CSBV对照组,且在摄入siRNA后感染CSBV的幼虫存活率明显上升,与CSBV组差异极显著(P<0.01)。通过本研究,证明了针对CSBV结构蛋白VP2基因的特异性siRNA能够介导产生RNAi,影响CSBV在中蜂体内的复制,为深入研究CSBV VP2基因的功能和研发抗CSBV生物制剂提供了理论基础。     

中华蜜蜂热休克蛋白70的克隆、表达及中蜂囊状幼虫病毒感染后表达差异分析

[目的]本研究旨在明确中华蜜蜂Apis cerana cerana热休克蛋白70 (Heat shock protein 70,HSP70)与中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)的关系.[方法]首先根据NCBI上已公布的中华蜜蜂HSP70的全基因(NO.MH122655.1)序列,设计特异性引物,提取3日龄中华蜜蜂幼虫总RNA,通过RT-PCR方法获得HSP70基因,并通过生物信息学软件进行分析;其次将其克隆到原核表达载体pET-32a中,转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达,并制备重组蛋白,将纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体;最后利用制备多克隆抗体作为一抗,通过Western-blot方法检测CSBV感染中华蜜蜂前后HSP70在幼虫体内的变化.[结果]成功获取中华蜜蜂HSP70蛋白的全基因,其核苷酸序列全长为1833 bp,生物信息学分析后,发现其编码蛋白存在7个抗原表位.利用原核表达系统,成功获得大小约87 ku的重组蛋白HSP70,免疫小鼠后获得多克隆抗体,经Western-blot分析能与标签蛋白发生特异性反应;对感染CSBV前后蜜蜂体内HSP70蛋白检测发现感染后HSP70表达水平显著提高.[结论]通过原核表达系统,成功表达中华蜜蜂HSP70基因和HSP70多克隆抗体,并证实CSBV感染后影响中华蜜蜂体内HSP70蛋白表达量的改变,为深入研究HSP70功能提供了帮助.     

去甲基万古霉素菌种低温冷冻、冷干保藏条件优化及10 年菌种保藏效果

【目的】针对去甲基万古霉素产生菌不耐保藏的问题,改进菌种保藏方法,对超低温液氮保藏、-80°C低温冷冻保藏、冷干保藏方法跟踪考察10年保藏稳定性,评价不同保藏方法对去甲基万古霉素产生菌的保藏适用性。【方法】采用甘油作基础保护剂进行超低温液氮保藏和-80°C低温冷冻保藏,采用脱脂牛奶作基础保护剂进行冷干保藏,针对超低温液氮保藏进行降温速率考察,研究非渗透性冷冻保护剂海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等对3种保藏方法的冻存影响,对优选出的保藏方法进行10年跟踪考察。【结果】3种保藏方法冻后菌种存活率依次为:-80°C低温冷冻保藏超低温液氮保藏冷干保藏。液氮保藏最适降温速率为快速冷冻。优选出最佳保护剂配方:超低温液氮保藏为甘油8.0%,海藻糖3.5%;-80°C低温冷冻保藏为甘油6.0%,PVP 5.0%;冷干保藏为脱脂牛奶,6.0%海藻糖。采用优化保藏条件,液氮保藏10年存活率稳定在70.6%,菌种发酵水平为入藏水平的92.9%。【结论】在优化条件下,尤以超低温液氮保藏适合于去甲基万古霉素产生菌长期保藏。     

川西高原三种雉类与其捕食者赤狐的空间关系

物种的空间分布会受到种间相互作用(如捕食关系等)和环境变量等多种因素共同影响。阐明环境变量和种间相互作用对同域物种空间分布关系的影响, 对于理解群落聚集和生物多样性的维持机制至关重要。为了解川西高原常见雉类与捕食者的空间分布关系及其驱动因素, 本研究利用2016-2018年在川西高原84个红外相机位点获得的682张目标物种的独立照片, 采用条件型双物种占域模型(conditional two-species occupancy model)在相机位点尺度评估了在川西高原广泛分布的黄喉雉鹑(Tetraophasis szechenyii)、血雉(Ithaginis cruentus)和白马鸡(Crossoptilon crossoptilon)与其捕食者赤狐(Vulpes vulpes)的空间分布关系。结果显示: (1)在物种作用和环境变量的共同影响下, 赤狐和血雉(物种相互作用因子, species interaction factor, SIF = 1.31 ± 0.14)与赤狐和黄喉雉鹑(SIF = 1.42 ± 0.41)在研究区域内的空间分布趋于重合, 赤狐和血雉的空间关系随距河流距离的增加呈现先重合后趋于分离的趋势, 而赤狐和黄喉雉鹑的空间关系随距河流距离的增加呈现出由重合转为分离的趋势。赤狐与白马鸡在空间分布上相互独立(SIF = 1), 白马鸡的空间分布主要受环境因子影响, 而赤狐对其没有影响。(2) 3种雉类的探测率受物种作用的影响, 在相机位点尺度上赤狐的存在减少了3种雉类的探测率(pB > rB)。本研究为物种空间分布关系的研究提供了新的案例, 也为理解物种共存机制和生物多样性保护提供了科学依据。     

曲美他嗪与稳心颗粒联合治疗不稳定性心绞痛疗效观察

目的:探讨曲美他嗪与稳心颗粒联合治疗不稳定性心绞痛临床疗效。方法:选取我院2011年6月-2012年6月不稳定性心绞痛患者150例,随机分为治疗组和对照组。对照组仅给予曲美他嗪治疗;治疗组给予曲美他嗪与稳心颗粒联合治疗。观察两组临床疗效、治疗前后心绞痛持续时间及发作次数、心电图改善情况及不良反应。结果:治疗组总有效率为86.8%,对照组总有效率为49.3%,两组疗效比较,差异具有统计学意义(P0.05);治疗组心电图总有效率为89.33%,对照组总有效率为72.00%,两组疗效比较,差异具有统计学意义(P0.05);治疗组心绞痛发作次数、持续时间、血液流变学指标较治疗前有显著下降(P0.05),较对照组有明显差异(P0.05)。两组患者治疗期间尿常规、血常规、肾功能、肝功能及电解质均未见明显变化,且两组患者不良反应差异无统计学意义(P0.05)。结论:曲美他嗪与稳心颗粒联合治疗不稳定性心绞痛临床疗效确切,具有很大临床意义。     

酱驴肉辐照贮藏技术研究

目的：分析探讨γ 射线辐照处理对酱驴肉的贮藏效果，建立适宜的辐照加工工艺参数。方法：采用不同剂量的60Coγ 射线对铝箔袋真空包装酱驴肉进行辐照处理，分析测定室温贮藏过程中，样品菌落总数、挥发性盐基氮等品质指标的变化。结果：2.0k～10.0kGy的不同辐射剂量处理能够有效杀死肉品表面污染微生物，抑制贮藏过程中菌落总数的增加，剂量越大杀菌效果越好，同时减缓了样品pH值上升和挥发性盐基氮含量的增加，但是对样品的色泽指标（L*值、a*值、b*值）和质构指标硬度、粘聚性的影响作用不明显。     

用半数变色单位法精确测定支原体活菌滴度北大核心CSCD

【目的】使用半数变色单位法实现对支原体活菌滴度的精确测定,以替代当前常用的CCU(变色单位)测定法。【方法】参考病毒滴度TCID50(半数组织细胞感染量)的标准测定方法,对早期学者提出的支原体活菌滴度指标—CCU50(半数变色单位)的测定方法进行改进,并做了重复性、敏感性试验以及与CCU的比对验证试验。为进一步验证该方法的适用性,使用其对猪肺炎支原体和鸡滑液支原体培养物进行了活菌滴度精确测定和评价。【结果】该方法可重复性良好,并具有较强的敏感性和适用性。【结论】CCU50测定法能对支原体活菌滴度进行精确评估,有望成为支原体培养工艺研究、支原体疫苗研发等方面的有效工具。     

产黄青霉转化载体pPIPKA的构建及青霉素工业生产菌株的转化研究

以腐草霉素(phleomycin)抗性为选择标记,构建了用于青霉素生产菌—产黄青霉Penicillium chrysogenum的转化载体pPIPKA。 以此转化当前的青霉素生产菌株NCPC-10086,建立了高效的工业生产菌株的基因转化体系,转化效率最高达18个转化子/g DNA。对转化子进行了PCR及Southern杂交分析,结果表明,外源基因整合到了宿主的染色体上。