人类21号染色体转录调节相关基因作为早期分子诊断标记物的可行性研究

目的分析与转录调节相关的人类21号染色体(HC21)基因在小鼠植入前胚胎发育过程中的表达模式,初步阐明这些基因与早期胚胎发育的关系,发现这些基因作为分子诊断标记物的可行性。方法应用植入前胚胎的GlobalRT-PCR方法,对BACH1、RUNX1、SIM-2、ERG、KIAA0136、GCFC、SON、PKNOX1、HSF2BP和NRIP1小鼠同源基因在植入前发育阶段的表达模式进行研究。结果RUNX1、ERG和SON在整个植入前发育过程中都未见表达。其他基因的表达呈现出阶段特异性表达的特点:BACH1几乎在整个发育过程中都有表达,但是存在着胚胎个体之间的差异,不适于作为分子标记物;SIM-2只在1和2细胞期表达;Kiaa0136在2、4细胞期以外的各个阶段均表达;除了1-和2-细胞期,GCFC在其它阶段普遍表达;PKNOX1只在1、8细胞以及桑椹期表达;而HSF2BP和NRIP1的表达仅见于成熟的卵母细胞和1细胞期胚胎。结论与转录相关的小鼠HC21同源基因大部分参与了早期胚胎发育的转录调节,这些基因的阶段特异性表达说明他们参与了早期胚胎发育的不同转录调节环节,对这些基因的深入研究是认识唐氏综合症发生的分子机制和发现早期分子诊断标记的基础。     

TIMP-1基因缄默削弱SH-SY5Y细胞的增殖潜能并诱导其凋亡增强

前期研究发现,人基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitors of metalloproteinases-1,TIMP-1)在唐氏综合征（Down’s syndrome ,DS)胎儿脑组织内表达下调．为了探讨TIMP-1表达下调参与DS脑病变发生的可能机制,本研究以人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）为模型,观察TIMP-1基因沉默后对其增殖和凋亡的影响．应用LipofectaminTM2000将TIMP-1特异性短发卡 RNA( short hairpin RNA,shRNA)导入SH-SY5Y细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定表达TIMP-1-shRNA细胞株;应用RT-PCR、real-time PCR和Western 印迹对干扰效率进行鉴定：与SH-SY5Y细胞相比,无论在mRNA水平还是蛋白水平,SH-SY5Y-TIMP-1-shRNA细胞中TIMP-1的表达显著下调（下调率接近100%）．结果显示,已成功构建了TIMP-1基因沉默的SH-SY5Y细胞模型．在此基础上,通过MTT检测发现,TIMP-1基因沉默后SH-SY5Y细胞增殖减慢;流式细胞仪和荧光显微镜凋亡检测显示,TIMP-1基因沉默后SH-SY5Y细胞凋亡明显增加．这些研究结果表明,TIMP-1基因沉默能削弱SH-SY5Y细胞的增殖能力并增强SH-SY5Y的凋亡效应,提示TIMP-1可能是通过影响神经细胞的增殖和凋亡参与DS智力低下的发病过程．     

用PCR方法定量检测多药抗性基因的表达

肿瘤细胞对化疗药物的抗性是癌症有效化疗的主要障碍。人类细胞中多药抗性基因(MDR1)编码一种p-糖蛋白,后者功能是能量依赖的跨膜药物外输泵,可降低细胞毒药物在胞内的积累。定量分析MDR1表达水平可说明病人抗药能力的高低。本文应用PCR技术建立了灵敏度高、专一性好、可定量检测临床标本中MDR1表达水平的方法。对周血标本的初步检测表明:白血病化疗效果与MDR1表达水平的高低有关。     

小鼠单个植入前胚胎SSH方法的可行性

为建立一种能够一次性分离任意两个植入前胚胎之间全部的差别表达的基因的方法 ,在已有的单胚胎操作技术的基础之上 ,对单个植入前胚胎抑制性消减杂交 (singlepreimplantationembryosuppressionsubtractivehybridization ,SPE SSH)方法进行了初步的探索 ,分离到OM2和MⅡ d 2的基因片段 ,经GenBank和文献检索发现 ,这两个基因具有在MⅡ期和 2细胞期特异性表达的特点 .利用cDNA阵列所进行的鉴定也获得了同样的结果 ,而且所使用的材料极少 ,说明SPE SSH是一种强有力的分离和识别早期发育相关基因片段的实验技术 .若与单个卵裂球分离技术相结合 ,还可用于分离和识别人类早期分子诊断的标记性基因     

SSH法分离早期发育相关基因片段

目的:分离和鉴定与小鼠合子基因组激活(ZGA) 以及母源调控向胚胎调控(MZT) 过渡事件 相关的基因片段,为进一步认识ZGA 和MZT 发生的分子机制奠定基础。方法:利用单个植入前 胚胎抑制性消减杂交(SPE2SSH) 的方法,对单个小鼠MⅡ卵母细胞和22细胞期胚胎进行双向消减 杂交;利用cDNA array 对获得的基因片段作进一步的鉴定。结果:从构建的消减杂交库中随机挑 取得31 个克隆,经cDNA array 鉴定发现其中有5 个MⅡ期特异表达的基因片段和9 个22细胞期 特异表达的基因片段,Genbank 检索发现其中10 个片段是首次报道在植入前发育阶段表达。结 论:这些基因片段具有明显的期特异性表达的特点,可能在ZGA、MZT 和胚胎植入前发育过程中 起着重要的作用。