兔胚胎时期特异性基因相关新片段的克隆

阶段特异性基因的表达是早期胚胎发育过程中的重要事件,对植入前胚胎基因表达模式的研究是进一步研究植入前胚胎发育调控机制的前提。本实验利用mRNA差异显示技术来研究兔(Oryctolagus cuniculus domestica)植入前各期胚胎的基因表达差异。在获得的42个阳性阶段特异性表达的基因中,有5个在NCBI和EMBL数据库中没有同源序列,登录EMBL,申请了登录号。这些新基因片段都是桑葚期特异表达的基因,而且在以后的囊胚期也有表达。兔由母源型调控向合子型调控的过渡是在8～16细胞期开始的,在桑葚期开始表达的这些基因片段应该是兔胚胎时期特异性基因。这些基因的克隆将为进一步研究兔的植入前胚胎发育模式奠定基础。     

mED2-一个小鼠胚胎发育的新基因

克隆参与胚胎发育的新基因并研究其表达规律和功能是揭示胚胎发育的基因调控机理的重要途径。囊胚形成和原肠形成是哺乳动物胚胎发育过程中的两个关键阶段。囊胚阶段发生了胚胎的第一次分化,是细胞多能性和分化的一个转折点。此时涉及的基因活动,既有维持胚胎干细胞全能性或多能性的基因活动,又有按照预定发育模式参与胚胎定向分化的基因活动。原肠期是胚胎发育过程中的第二个关键转折点,涉及到3个胚层的形成和细胞命运决定等多种变化。在这个时期胚胎获得了胎儿原基的所有信息,新组织的产生和细胞迁移的再生组织与形态发生、细胞增殖、细胞分化、模式形成等存在着非常复杂而相互协调的关联。大多数细胞正由原来的多潜能逐渐向寡潜能发展,控制组织器官形态建成的基因正逐渐开启。这两个时期的基因表达图式、特征和种类会有很大的差异和变化,因此研究这两个时期的新基因的表达规律和功能,将是了解胚胎发育的基因调控机理的重要途径。文章以这两个时期胚胎为原始材料,利用减法杂交方法克隆到一新的小鼠胚胎基因mED2,对其进行了表达规律和生物学功能的初步分析。RT-PCR-Southern和原位杂交实验表明,mED2基因转录水平具有发育阶段的依赖性;随着发育过程的进行,其表达主要在胚神经系统和中胚层衍生的组织表达。mED2基因活性的knockdown对于合子的卵裂和植入前早期胚胎发育均有抑制作用。亚细胞定位实验表明,mED2基因编码的蛋白基本定位于细胞核膜及其临近的内膜细胞器（粗糙内质网和高尔基体）。根据生物信息学分析,mED2蛋白可能为一跨膜蛋白且与含有硫氧还蛋白结构域的蛋白有部分匹配。由此推测mED2基因参与了小鼠植入前早期胚胎发育,其基因产物可能通过蛋白之间的相互作用,即对蛋白进行后期修饰、折叠及行使分子伴侣等作用来活化或抑制其靶蛋白的活性,进而参与小鼠的早期胚胎发育。     

转录因子Oct4、Sox2和Nanog在早期胚胎发育过程中的表达调控

胚胎发育的分子机理是现今胚胎工程及发育生物学研究迫切需要了解的。由于胚胎发育的早期阶段就是胚胎干细胞阶段,因此两者在研究上有很好的重合性。通过对调节胚胎干细胞基因转录的三个具有代表性的转录因子Oct4、Sox2和Nanog的综述,展现出胚胎发育分子机理研究概况。     

人胚胎干细胞和拟胚体基因表达谱的初步分析

利用人类全基因组Affymetrix芯片检测人胚胎干细胞与其自发分化7d的拟胚体之间的差异表达基因.结果显示:与未分化的人胚胎干细胞相比.在分化7d的拟胚体中表达下调2倍及以上的已知和未知基因共有1100个,表达上调2倍及以上的已知或未知基因共有2283个.利用Gostat对这些差异表达基因进行功能分析,发现它们分别与细胞的生物代谢过程、信号传导通路、系统发育、细胞分化、分子功能及亚细胞组分相关.胚胎干细胞具有自我更新能力,是研究早期胚胎发育理想的细胞模型,因此对差异表达基因的功能研究有助于了解维持人胚胎干细胞自我更新的分子机制以及胚胎发育早期的分子事件.     

前蛋白转换酶Furin和PC7在小鼠母胎界面的动态表达及其在胚胎粘附和扩展中的作用

通过免疫组化、免疫荧光和小鼠胚胎-子宫内膜上皮细胞共培养体系,研究了前蛋白转换酶Proprotein Convertases (PCs)家族中的Furin和PC7在小鼠妊娠早期子宫和胚胎中的表达及对胚胎植入的影响.结果显示:Furin和PC7在妊娠D1-D4小鼠子宫的腺上皮和D5-D7小鼠子宫的蜕膜、腺上皮高表达;PC7在植入前胚胎的2-细胞和4-细胞期表达很低,8-细胞期表达开始增加,囊胚期滋养外胚层有显著的高表达.Furin的抑制剂Dec-RVKR-CMK可显著抑制共培养体系中胚胎的粘附和扩展.以上结果表明,Furin在植入期胚胎的粘附和扩展中发挥重要作用.此外,Furin和PC7可能参与子宫内膜蜕膜化和早期胚胎发育.     

TFIID在配子发生和早期胚胎发育过程中的作用

配子发生以及胚胎早期发育过程受严格且有序的基因表达调控。多种转录因子与靶基因结合,激活基因的时空特异性表达,实现受精卵全能性的获得,完成母型基因组转录调控向合子基因组转录调控的转变以及随后胚胎细胞的分化调节。研究表明,TFIID转录因子家族在这些关键阶段起重要作用,在基因转录调节的起始阶段,TFIID转录因子家族成员作为通用转录因子被招募到靶基因的启动子上,与其他转录因子共同形成转录前起始复合物,起始转录。该文总结了TFIID转录因子的结构、作用方式,以及在配子发生和早期胚胎发育中的调控作用。     

囊胚形成的基因表达与调控

囊胚形成是胚胎早期发育过程中一个重要阶段,涉及几个重要的生理事件,即细胞融合（compaction,亦称致密化作用）、囊胚腔出现、囊胚腔扩张及滋养层和内细胞团的分化。在细胞间连接蛋白的作用下,各种细胞间连接方式逐步建立起来,在合子型基因组表达调控下,促进了最终囊胚的形成。细胞间连接蛋白和细胞粘附相关蛋白参与组建各种细胞间连接,参与细胞融合、囊胚腔形成、滋养层分化和囊腔扩张等过程。通过顶部的紧密连接、侧部的缝隙连接和桥粒,建立起细胞的连接复合体。在人胚胎8－细胞之前,卵裂球细胞界限明显,可能从中间连接方式相互作用;8－细胞期发生致密化作用,通过紧密连接将细胞分成顶部和基部,使得胚胎处于半封闭状态,促进胚胎内部积液,形成囊胚腔。细胞融合的同时也产生缝隙连接。桥粒最初出现在人胚胎达到32－细胞阶段,桥粒连接参与囊胚腔形成以及在囊胚扩张时维持滋养层的稳定性。桥粒由一些跨膜粒蛋白组成,包括参与细胞内粘附的桥粒子和桥粒球以及一些细胞质内蛋白（如desmoplakins,plakoglobin,plakophilin),由细胞内蛋白质形成空斑结构并介导细胞角蛋白丝固定。对植入前牛胚胎的研究表明,只有DcII,DcIII和plako三种桥粒蛋白参与桥粒组建。在鼠囊胚中DcII的表达部位位于滋养外胚层,对于滋养层的形成具有重要的作用。在牛中,直到桑椹胚期可能才出现紧密连接方式。人胚胎发育至囊胚期时,可检测到角蛋白－18基因的活跃表达,作为细胞骨架蛋白的角蛋白－18参与桥粒位点的细胞与细胞间“识别”的建立。缝隙连接蛋白连接子（Connexin43,Cx43)对于维持细胞融合以及之后囊胚的形成是十分必要的。细胞融合和囊胚腔形成还需要一些介导细胞粘附和滋养层细胞分化的分子表达,如整合素家族中的E－钙调素、链接子（caknin)和ZQ（一种细胞质带状咬合紧密连接相关蛋白）。Na/K-ATP酶基因及细胞因子、生长因子等可促进Na^ 浓度梯度变化,使水分进入囊胚内部,形成囊胚腔,并维持囊腔腔扩张状态。调节发育和分化的基因参与胚胎的发育和内细胞团和滋养外胚层细胞的分化,调节胚胎由未分化状态向分化状态过渡。另外,某些细胞因子对内细胞团细胞增殖有影响。在小鼠胚胎培养基中,添加IGF和EGF有利于胚胎从透明带孵出,TGF－α和EGF在小鼠胚胎发育中能分别通过自泌作用和旁分泌作用囊胚腔的扩张膨大。许多基因参与囊胚的发育和分化,如Pem基因调节早期胚胎细胞分化,可调节鼠早期胚胎由未分化状态向分化状态过渡,Oct-4表达与未分化表型有关,在早期胚胎发育中起转录调节作用。植入前胚胎发育基因调节鼠胚植入前卵裂速度的快慢,以及胚胎预后生存能力。植入前因子PIF在受精后妇女的血清中就能检测出来,其特点和功能与囊胚形成的关系仍需进一步研究。Rex-1编码锌指蛋白,可能是一个转录调节因子,它参与滋养层发育以及精子发生,它是研究内细胞团早期细胞命运决定的有用标志物,对于维持胚胎干细胞的未分化状态和全能性有作用,当其表达显著降低时,内细胞团将分化成胚层。总之,多种蛋白、因子参与囊胚形成的表达调控。通过基因调控的研究,将有助于培养液的研制以及通过测定一些标志基因的表达筛选健康的胚胎。     

热休克蛋白（HSPs）在胚胎发育中作用的研究进展

在胚胎发育,特别是早期胚胎发育时期,基因转录活跃、蛋白质大量合成,细胞的增殖和分化非常剧烈,细胞的环境在不断变化,细胞对外界刺激十分敏感。这个时期的HSPs变化和作用表现得非常突出。本文简要总结了近十年有关热休克蛋白在胚胎发育中作用的研究成果。根据胚胎发育地HSPs的依赖性、HSPs基因表达的发育阶段特异性和组织特异性、干扰胚胎发育中HSPs表达程序以后导致胚胎异常发育等现象推测：（1）热休克基因与和／功调控体形形成、肌肉及神经分化,而在胚胎发育中具有看家基因的功能;（2）热休克蛋白作为伴侣分子,通过介导新合成的和／或可逆变性的蛋白质正确折叠、装配、转动及促进不需要的和／或不可逆变性的蛋白质降解,参与胚胎的正常发育和保护胚胎不受不良刺激的影响。这方面的深入研究,必将有助于阐明胚胎发育、细胞增殖、细胞分化和去分化、细胞转化、生物适应性等的分子机理。     

家蚕细胞周期蛋白基因BmCcnl1的克隆及表达分析

家蚕Bombyx mori由受精卵到完成胚胎发育孵化的过程中, 细胞进行大量的分裂和分化, 然而滞育性卵的胚胎细胞分化至G2期便停滞在此阶段。为了探索这一发育阶段细胞内的分子调控, 本研究以人Homo sapiens的细胞周期蛋白基因cyclin L1为模板, 成功克隆了家蚕同源基因BmCcnl1（GenBank登录号: FJ889988）。BmCcnl1基因开放阅读框（open reading frame, ORF）全长1 254 bp, 编码417个氨基酸。利用Protean软件分析得出BmCcnl1蛋白预测分子量为49 kDa, 等电点为9.84。利用DNA重组技术构建了BmCcnl1基因的重组表达载体pET-21d-BmCcnl1, 对其进行原核表达, 其表达的蛋白以包涵体形式存在。利用RT-PCR技术分析了BmCcnl1基因在胚胎发育过程中的转录水平, BmCcnl1基因在非滞育性卵的胚胎发育阶段基本保持相对稳定的转录表达, 而滞育性卵从蛾体产下经过72 h后已经检测不到BmCcnl1基因的转录。结果提示, BmCcnl1基因与胚胎期滞育及非滞育性卵的发育调控相关。对该基因的克隆和表达分析为今后研究家蚕胚胎发育及细胞周期调控奠定了基础。     

关键基因和相关激素在植物胚胎发生前后期的作用

虽然LEAFY COTYLEDON 1-LIKE与LEAFY COTYLEDON1同为LEAFY COTYLEDON1型的AHAP3亚基,但是与主要在胚胎发育晚期发挥重要作用的LEAFY COTYLEDON1不同,LEAFY COTYLEDON 1-LIKE在体细胞胚胎发育的早期具有把营养阶段的细胞转化为胚胎期细胞的能力。而与LEAFY COTYLEDON类基因同样具有特异性B3结构域的LEAFY COTYLEDON2转录因子,能够通过IPA-YUC生长素合成途径参与在体细胞组织中创造胚胎发生的环境。除此之外,LEAFY COTYLEDON2还通过调节ABA/GA的比例来促进胚胎的发生及其发育。胚胎晚期的WUSCHE和SHOOTMERISTEMLESS的表达相互独立但又协调的维持SAM的功能,独立于WUSCHE基因表达的KNOX途径与激素的交互作用,能够维持胚胎茎顶端分生组织中高浓度的CK和低浓度的GA环境,有利于WUSCHE-CLAVATA途径响应于CK持续产生干细胞。综上所述能够提高对胚胎发生分子调控网络的认识,在未来更深入的胚胎发生研究中奠定分子基础。