丙型肝炎病毒感染的体外培养细胞的抗原表达

建立丙型肝炎病毒（HCV）体外感染细胞模型,观察其感染细胞的HCV抗原表达,用抗HCV抗体和HCVRNA阳性及阴性血清感染MOLT-4细胞,制备细胞片进行免疫酶染色。结果显示HCV感染MOLT-4细胞4天和阴性对照HCV抗原均为阴性;感染后7天胞浆内可见HCV抗原阳性免疫反应产物;15天阳性细胞达到高峰,43天仍可见少量阳性细胞。结果表明HCV体外感染MOLT-4细胞胞浆内观察到HCV抗原表达。     

人毒素源性大肠杆菌热敏感肠毒素基因的克隆和表达

用限制酶Pst I完全消化毒素源性大肠杆菌H10407的热敏感肠毒素(LT)质粒DNA,酶切片段经电泳分离后,用southern分子杂交技术定位LT基因。回收5．3kb的LT DNA片段并将它与Pst I完全酶解的pUC8DNA混合,体外连接后用于转化感受态E．Coil JM83细胞。筛选后获得了一株能有效表达LT的重组子。免疫学及生物学测定表明,此克隆株所产生的LT与亲本株H10407所产生者具有相同的免疫原性和生物活性,且其产最为亲本株的16倍。     

人白介素6受体功能区片段在E．coli中的表达

通过ＤＮＡ体外重组技术,以ｐＥＴ－３ｂ为表达载体,构建了重组表达质粒ｐＥＴ－６Ｒ（Ｂ）和ＰＥＴ－６Ｒ（Ｂ）４,分别编码２８ｋＤ的ｈＩＬ－６Ｒ配基结合区片段及其５３ｋＤ的二联体蛋白,并为酶切分析和ＤＮＡ序列分析所证实。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,含有重组表达质粒的菌株可分别表达出２８ｋＤ的蛋白ｒＩＬ６Ｒ－２８和５３ｋＤ的ｒＩＬ６Ｒ－５３。重组蛋白分别占菌体总蛋白的４５％和２９％左右。重组蛋白主要以包涵体形式存在,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹表明重组蛋白具有ＩＬ－６Ｒ的抗原性。     

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型核心蛋白(p24)在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

在大肠杆菌中,利用新构建的含T7g-10L RBS以及λ-PR启动子的新型原核表达载体,通过表达gag-pol基因片段,获得了具有天然序列的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核心蛋白p24的高效表达。克隆的gag-pol基因片段在其阅读框架移位区域插入了4bp碱基,其表达的病毒蛋白酶在阅读框架上与gag一致,从而实现了对gag-pol融合蛋白的有效加工,产生成熟的核心蛋白p24及其它产物。重组p24以可溶形式存在,可以被抗p24的单克隆抗体特异识别。测定的N端8个氨基酸序列与从病毒纯化的p24完全一致。在使用硫酸铵沉淀后,采用两步离子柱层析,可将重组蛋白纯化到95％以上的纯度。结果表明,纯化的p24可以作为特异性很强的试剂而用于HIV感染的诊断及病情的预后,并可用于p24的生化及结构分析。     

HCV C基因在E.coli中的高效表达

本文在基因克隆和序列分析基础上,设计并构建了五种不同的HCV C基因表达工程菌株,研究了影响HCVC基因在E.coli中高效表达的因素。结果表明疏水区编码序列的存在与否对基因表达水平影响较大;翻译通读现象可直接影响目的表达产物的累积水平;不同宿主细胞对外源基因表达水平的影响也同样具有重要意义。通过试验研究,获得了高表达工程菌株,其表达水平达38.5％,为制备高质量重组HCV C抗原并研究其在疾病防治中的作用奠定了基础。     

含色氨酸启动子载体pMM16的构建

在基因工程中,一个好的表达载体(expression vector)必须具有强启动子和插入筛选标志。Edman等构建的ptrpL1载体(图1)虽然含有强启动子一色氨酸(trp)启动子,但没有插入筛选标记。因此,插入重组体的筛选非常困难。细菌必须同时具备半乳糖异构酶、半乳糖转移酶和半乳糖激酶才能发酵半乳糖,这三种酶分别由galE galK和galk基因控制。Mckenney等构建的pKO-6质粒只含有galK基因,且galK基因上游(upstreem)无启动子(图1),故galK基因不能表达,此质粒转化galE~ T~ K~-细胞(如E.coli RR1)不能与宿主细胞发生互补发酵     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在杆状病毒载体与昆虫细胞体系中的表达

根据杆状病毒A组代表种苜蓿Y纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica Nuclear Po-lyhedrosis Virus,简称AcNPV)的分子生物学资料,我们采用分子剪裁和拼接手段,对AcNPV多角体蛋白基因加以修饰,并用人工合成定位探针,获得大约在该基因的ATG转译起始密码子一9处加有合成BamHl连接序列的转移载体质粒pAc—MV。 再与从乙肝病毒adw亚型的表面抗原基因HBng亚克隆株pYPss一1分出带有Ban·Hl粘性末端的HBsAg基因,构建表达载体质粒pAc—MV—HBsAgo经与野生型AcNPV DNA对Spodoptem 7rugJPerda细胞共转染,借助同源交换,获得插有HBsAg基因的多角体缺陷的重组病毒。根据HBsAg诊断血球凝集试验和HBs^g诊断酶标免疫测定,表明重组病毒使HBsAg基因在昆虫细胞中得到了表达,免疫电镜显示表达产物呈球状颗粒,大小约为22nm。表达产物粗制品按1μg／鼠对bal b／c鼠免疫,并于三周后强化免疫能产生抗体。由HBsAg纯样品酶标免疫法标定的标准曲线估计每升培养物的表达产物约{一8mg,细胞量为1一2×106个/ml.用重组病毒感染玉米螟4龄幼虫,也获得HBsAg基因的表达,展示了简易生产HB sag诊断试剂和疫苗的可喜前景。     

基因工程产物纯化工艺的设计

基因工程产物纯化工艺的设计徐明波,马贤凯（军事医学科学院基础医学研究所）工艺的设计和操作单元的选择是一个在尝试和失败中不断积累经验的过程,与工艺设计者的知识水平与经验有关。前人工作的总结是获得设计思路的重要途径［１］。一、影响工艺设计的因素分析１．活性、纯度和杂质分析首先应建立活性、纯度及可能含有杂质的检测方法,以评价工艺的可靠性。     

利用聚合酶链反应扩增基因片段

聚合酶链反应(PCR)是一种模拟天然DNA复制过程的核酸扩增法,具有敏感特异、产率高、操作简单、容易自动化等特点。由于它有成指数倍(2~n)扩增靶序列的能力,又被称之为“无细胞分子克隆”或“试管内分子克隆”。我们以化学合成的寡核苷酸的粗提物为引物,含目的基因片段的重组质粒DNA为模板,利用PCR技术成功地扩增出数百至3544bp的特异性     

人白细胞介素6cDNA克隆的分离与鉴定

我们从重组的人α干扰素处理的单层HeLa细胞常规提取Poly(A)~+RNA作为逆转录合成cDNA第一链之模板,用引物-适配接头法在噬菌质粒pTz19R中构建cDNA文库。以~(32)p-标记的480bpIL-6cDNA片段作探针进行菌落原位及狭缝印迹杂交,筛选出6个阳性克隆。其中两个克隆并用限制酶切分析及DNA序列测定做进一步鉴定。结果证明,一个克隆的cDNA片段长1.3kb,含有人白介素6全长编码区;另一个的cDNA插入片段为0.9kb,缺乏信号肽及成熟IL-6N端30个残基的编码序列。