鼻病毒非结构蛋白2B 诱导细胞发生内质网应激

为探讨鼻病毒非结构蛋白2B诱导内质网应激和细胞凋亡的机制,本研究构建了鼻病毒非结构蛋白2B的真核表达载体p2B‐GFP ,通过转染BHK‐21细胞检测相关标志蛋白的变化情况。结果显示,非结构蛋白2B定位表达于BHK‐21细胞内质网,诱导内质网应激标志蛋白Grp78、CHOP的表达增加,并使活化转录因子6（ATF6）的转录活性增加,还诱导BHK‐21细胞发生核浓缩而凋亡,使凋亡标志蛋白PARP发生降解而减少。结果提示,鼻病毒非结构蛋白2B可诱导细胞发生内质网应激,并经该途径诱导细胞凋亡。     

柯萨奇病毒B3型感染引起HeLa细胞内源性小干扰RNA的变化

探究柯萨奇病毒B3型(Coxsackie virus type B3, CVB3)感染的细胞是否诱导内源性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的产生。以CVB3接种HeLa细胞,在细胞培养箱(5% CO2、37 ℃)孵育1 h。随后加入含2%血清的细胞维持液,继续培养3 h和6 h后收集细胞。用高通量测序(二代测序) 试剂盒提取细胞RNA,并反转录合成cDNA,构建文库,上机测序。过滤数据,去除插入片段过长的序列、低质量序列、poly A序列和小片段序列,与已知的小RNA数据库比对鉴定siRNA。通过茎-环反转录-聚合酶链反应,证实内源性siRNA在感染CVB3后的表达。结果显示,感染CVB3 3 h和6 h后,HeLa细胞产生了多种内源性siRNA。其中内源性siRNA(novel_sir3502和novel_sir2806)在感染后3 h和6 h均可持续表达。经比对,novel_sir3502和 novel_sir2806均可以识别45S和28S核糖体前体RNA。结果提示,CVB3感染可能干扰核糖体成熟。     

一种非洲猪瘟病毒假病毒细胞感染模型的建立及应用

目前国内外大多数针对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的研究须在生物安全三级实验室(biosafety level 3 laboratories, BSL-3 labs)中进行,因此针对该病毒的感染过程、中和抗体逃逸机制、药物研发等研究受到了一定限制。鉴于此,本研究选择ASFV包膜蛋白中与其进入细胞紧密相关的蛋白p12、CD2v、p30、p54和pE248R,构建表达这5种包膜蛋白的真核表达质粒,利用水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)假病毒包装体系,制备多种ASFV假病毒。以荧光素酶报告基因实验(luciferase assay)检测假病毒感染水平;选择1个包膜蛋白为代表,使用蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测其在假病毒中的表达情况;采用芫花素检测其对所建立的ASFV假病毒(p30-pE248R-ASFV-PsV)的抑制活性。结果显示,VSV包装体系以及p30、pE248R包膜蛋白质粒的组合制备方法所包装出的假病毒具有较优的感染活性,适合用于建立细胞感染模型。ASFV的包膜蛋白pE248R被有效整合到VSV-ΔG rLuc颗粒中,并包装出ASFV假病毒。芫花素可浓度依赖性地抑制ASFV假病毒感染Vero细胞,其半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)为4.05±0.88 μmol/L。本研究通过建立基于ASFV假病毒的细胞感染模型,筛选获得了1种可感染已报道的一些ASFV敏感细胞的假病毒。该假病毒无复制性,可在生物安全级别较低的实验室中进行操作,并且带有海肾荧光素酶报告基因,有望用于ASFV入侵抑制剂的高通量筛选及中和活性的初步评价,为研发抗ASFV药物提供了一个安全、方便的研究模型。