鼻病毒非结构蛋白2B 诱导细胞发生内质网应激

为探讨鼻病毒非结构蛋白2B诱导内质网应激和细胞凋亡的机制,本研究构建了鼻病毒非结构蛋白2B的真核表达载体p2B‐GFP ,通过转染BHK‐21细胞检测相关标志蛋白的变化情况。结果显示,非结构蛋白2B定位表达于BHK‐21细胞内质网,诱导内质网应激标志蛋白Grp78、CHOP的表达增加,并使活化转录因子6（ATF6）的转录活性增加,还诱导BHK‐21细胞发生核浓缩而凋亡,使凋亡标志蛋白PARP发生降解而减少。结果提示,鼻病毒非结构蛋白2B可诱导细胞发生内质网应激,并经该途径诱导细胞凋亡。     

青年人群感染Omicron的细胞因子动态变化特征

为了评价2022年12月至2023年3月北京市SARS-CoV-2 Omicron BA.5和BF.7变异株感染青年人群感染前和感染后7d、14d和21d细胞因子免疫谱的动态变化,预防过度炎症反应和严重疾病的发生,采用Cytek Aurora全光谱流式细胞仪（Cytek, America）检测15例感染者在SARS-CoV-2感染前、感染后（7d、14d和21d）的血清样本中12种细胞因子的表达水平,评价细胞因子在SARS-CoV-2感染前后的动态变化特征。本研究成功构建了SARS-CoV-2感染青年人群细胞因子免疫谱的纵向研究队列。研究结果发现感染SARS-CoV-2后,各细胞因子与感染前相比均有显著的动态变化。IL-6、IL-17A、MIP-1β在感染后第7d显著升高,第14d和第21d逐渐下降。与感染前相比,感染后IL-2、IL-4、IL-22和IL-9的表达水平显著升高,并维持在较高水平一直持续至21d。与感染后IL-6的快速升高相比,TNF-α、IL-10、IFN-γ、IL-8、和RANTES在感染后缓慢升高,在第14d或第21d达到最高表达水平,提示这些细胞因子的变化伴随着...     

EV71通过2A蛋白酶切割Nup62而抑制核转运

为了解EV71病毒对细胞核转运机制的影响,本研究构建了具有核定位信号的绿色荧光蛋白表达载体(pG-FP-NLS)。将此表达载体转染细胞后,使用EV71病毒感染转染细胞,结果发现EV71病毒可以有效阻止绿色荧光蛋白的核转移。将EV71病毒的2A蛋白酶真核表达载体与pGFP-NLS共转染RD细胞,可以发现2A蛋白酶可阻止具有核定位信号的绿色荧光蛋白的核转移而使绿色荧光蛋白表达于细胞浆。为了进一步研究病毒阻止核转移的机制,病毒感染细胞或通过转染2A蛋白酶真核表达载体进行Nup62的Western blotting检测,结果显示病毒以及2A蛋白酶均可引起Nup62表达下降。证明EV71可通过2A蛋白酶切割Nup62从而抑制核转运。     

柯萨奇病毒B3蛋白酶2A干扰核因子κB p65的二聚体形成和核转移

为探讨柯萨奇病毒B3(CVB3)蛋白酶2A是否通过干扰核因子κB(NF-κB)的核定位而影响细胞因子表达,构建CVB3蛋白酶2A的表达载体pcDNA3.1-2A。将此表达载体与核转录因子NF-κB基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-NF-κB promotor-Luc共转染细胞,经肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激,检测荧光素酶表达;通过免疫荧光和蛋白免疫印迹检测CVB3蛋白酶2A对NF-κB核定位和二聚体形成的影响。结果显示,CVB3蛋白酶2A可减少NF-κB二聚体形成,并干扰其核转移。本研究证实,CVB3蛋白酶2A可通过干扰NF-κB二聚体形成和核转移而影响细胞因子分泌。     

细胞自噬促进柯萨奇病毒B3复制的研究

本研究探索柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)感染引起的自噬与病毒复制之间的关系。CVB3感染HeLa细胞,并在病毒感染后6 h、8 h和10 h时检测LC3-Ⅰ蛋白、LC3-Ⅱ蛋白和p62蛋白的表达水平。结果显示CVB3病毒感染促使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,同时降低p62蛋白的表达。分别将自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamy-cin)、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3MA)或溶酶体抑制剂阿洛司他丁(Aloxistatin,E46D)预处理HeLa细胞2 h,CVB3感染药物处理细胞并在病毒感染6 h后收集细胞、检测CVB3病毒VP1蛋白的表达。结果显示雷帕霉素和E64D促使CVB3病毒VP1蛋白表达增加,而3MA降低CVB3病毒VP1蛋白的表达。本研究得出结论 CVB3病毒感染诱导自噬进而促进病毒复制。     

PrP106-126多肽诱导凋亡细胞中14-3-3β的降解

本研究将PrP106-126多肽和HeLa细胞共孵育4h和8h,采用Hoechst染色分析发现PrP106-126诱导凋亡细胞细胞核出现不同程度的染色质浓集,固缩及碎裂的细胞凋亡征象。Western blotting检测发现PrP106-126诱导细胞中的多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)降解,提示PrP106-126通过caspase3途径引起细胞凋亡现象。PrP106-126诱导的细胞中14-3-3β在不同孵育时间也出现降解,而Real-time PCR检测14-3-3β mRNA未发生变化。本研究证明PrP106-126通过caspase3诱导HeLa细胞凋亡,并可导致抗凋亡蛋白14-3-3β的降解而加速凋亡的形成。     

柯萨奇病毒B3型感染引起HeLa细胞内源性小干扰RNA的变化

探究柯萨奇病毒B3型(Coxsackie virus type B3, CVB3)感染的细胞是否诱导内源性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的产生。以CVB3接种HeLa细胞,在细胞培养箱(5% CO2、37 ℃)孵育1 h。随后加入含2%血清的细胞维持液,继续培养3 h和6 h后收集细胞。用高通量测序(二代测序) 试剂盒提取细胞RNA,并反转录合成cDNA,构建文库,上机测序。过滤数据,去除插入片段过长的序列、低质量序列、poly A序列和小片段序列,与已知的小RNA数据库比对鉴定siRNA。通过茎-环反转录-聚合酶链反应,证实内源性siRNA在感染CVB3后的表达。结果显示,感染CVB3 3 h和6 h后,HeLa细胞产生了多种内源性siRNA。其中内源性siRNA(novel_sir3502和novel_sir2806)在感染后3 h和6 h均可持续表达。经比对,novel_sir3502和 novel_sir2806均可以识别45S和28S核糖体前体RNA。结果提示,CVB3感染可能干扰核糖体成熟。