高效合成葡萄糖二酸酿酒酵母工程菌的构建

葡萄糖二酸是天然存在的一种重要二元酸,其在医疗保健和化工工业等领域具有很高的实际应用价值,因此被称为“最具价值的生物炼制产品之一”。以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为底盘微生物,文中考察了过量表达肌醇转运蛋白Itr1、融合表达肌醇加氧酶和葡萄糖醛酸脱氢酶以及弱化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1三种策略对葡萄糖二酸产量的影响。研究结果显示,过量表达肌醇转运蛋白Itr1使葡萄糖二酸产量在摇瓶发酵条件下较出发菌株Bga-3提高了26%;MIOX4-Udh融合蛋白的表达使葡萄糖二酸的产量较Bga-3菌株提高了40%;在此基础上,弱化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1后,葡萄糖二酸的产量达5.5 g/L,较相同发酵条件下Bga-3菌株提高了60%。在5 L发酵罐中,该菌株葡萄糖二酸的最高产量达10.85 g/L,较Bga-3菌株提高了80%。由此可见,上述代谢改造策略的应用在很大程度上提高了葡萄糖二酸的途径效率和产量,为通过代谢工程方法在酿酒酵母中合成其他化合物的研究提供了参考。     

苏云金杆菌ZLL13晶体蛋白分析及其菌糠液态培养基的优化

食用菌栽培废料,简称菌糠(spent mushroom substrate, SMS)是食用菌栽培和生产的残留物,其含有丰富的甲壳素、木质纤维和蛋白质等,可为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)的生长提供所需的营养物质。本研究以优化后的前处理条件制备的菌糠浸提液(2%硫酸, 121℃, 1 h)作为主要碳源,通过单因素试验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡和响应面分析等方法来优化最佳培养基组分,结果表明,54%SMS浸提液,31.9 g/L大豆饼粉、0.88 g/L CaCO3、0.4 g/L MnSO4、0.5 g/L K2HPO4和0.4 g/L吐温100为最佳培养基配方,且优化后培养基(1.8×108/mL)产生的孢子数是原始SMS培养基(0.065×108/mL)的27倍,这不仅为菌糠的二次利用提供一种新的有效方法,而且也可以大大降低生产Bt所需要的发酵成本,具有良好的应用前景。     

CRISPR/Cas9编辑雪兔Corin基因载体的构建

[目的]通过CRISPR/Cas9系统构建雪兔Corin基因编辑载体。[方法]通过在线CRISPR设计工具设计2个靶点,退火制备sgRNA双链,用BbsⅠ酶得到线性p X330载体后,经重组酶连接得到重组质粒。将重组质粒转化到DH5α感受态细胞,再对其进行PCR鉴定及测序比对分析。[结果]通过特异性扩增以及测序结果表明sgRNA准确地连入载体,插入序列无突变,与预期序列高度一致,重组子阳性率为100%。[结论]成功构建了雪兔Corin基因敲除载体,为进一步利用CRISPR/Cas9技术进行雪兔Corin基因编辑工作提供了研究基础。     

茄科劳尔氏菌单克隆抗体的制备及其特性鉴定

茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum,RS)是番茄、茄子、辣椒、马铃薯等茄科蔬菜青枯病害的致病菌。为实现对RS的快速高效检测,以茄科劳尔氏菌株1.76免疫BALB/c小鼠,经细胞融合后利用间接酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)筛选出3株能稳定分泌抗茄科劳尔氏菌株1.76的单克隆杂交瘤细胞株1C1、1B3和9D7。然后利用小鼠体内诱生腹水,1C1、1B3和9D7效价分别为1:1 024 000、1:64 000、1:256 000。采用饱和硫酸铵沉淀及Protein-G亲和层析法纯化腹水,经SDS-PAGE鉴定显示纯化后的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies,mAb)纯度较高。纯化后单克隆抗体(2 mg/mL)效价分别为1:17 529、1:35 819、1:50 000,抗体亚型均为IgG1。对3株抗体进行特异性检测结果显示,1C1和9D7均不能与RS-5结合,1B3不能结合1.74和RS-5。此外,检测结果还表明3株单克隆抗体与桑肠杆菌JX-6、苏云金芽胞杆菌SYJ及实验室现有11株燕麦嗜酸菌卡特莱兰亚种、燕麦嗜酸菌西瓜亚种、玉米细菌性条斑菌、嗜酸菌魔芋亚种,梨火疫病菌QB0809、 XL-4,玉米细菌性枯萎病菌QB0241、QB0242,水稻细菌性谷枯病菌QB0017、QB0753、QB0755均无交叉情况。此次茄科劳尔氏菌抗体的制备,为后期青枯病菌的快速检测提供参考。     

肥厚梗阻性心肌病的外科治疗

目的：总结肥厚室间隔切除术治疗肥厚梗阻性心肌病的手术效果,探讨外科治疗策略。方法：2002年3月至2010年10月,外科手术治疗33例肥厚梗阻性心肌病病人。其中男16例,女17例;年龄13～59岁,平均（42.7±13.6）岁;左室流出道压差（LVOTGP）70～120 mmHg（1 mmHg=0.133Kpa）,平均（95.0±22.6）mmHg。其中合并二尖瓣关闭不全24例,主动脉瓣关闭不全7例,升主动脉增宽3例,冠心病2例。手术在全麻低温体外循环下完成,按常规经主动脉切口行室间隔心肌切除术,同期完成二尖瓣置换术（MVR）7例,二尖瓣成形术（MVP）7例,二尖瓣、主动脉瓣成形术（MVP＋AVP）5例,二尖瓣、升主动脉成形术3例,二尖瓣、主动脉瓣成形、冠状动脉旁路移植术（MVP＋AVP＋CABG）2例。分析比较病人术前超声心动图（UCG）,术中经食管心脏超声（TEE）,以及术后1周、3月、6月、1年超声心动图结果。结果：手术死亡1例（3.0%,1/33例）,主要死因为严重低心排综合症以及多脏器功能衰竭。二次开胸止血1例（3.0%,1/33例）。术中经食管心脏超声示所有病人二尖瓣前叶收缩期前向运动现象（SAM征）消失。存活病人手术效果良好,解剖狭窄解除,峰值压差降低,SAM现象基本消失。远期随访生存病人症状消失,生活质量明显改善,心功能I～II级,无远期死亡、并发症或再次手术。结论：外科治疗肥厚梗阻型心肌病具有良好的手术效果。了解病生理过程、术中仔细探察、手术切除彻底是手术成功的关键。     

免疫应答——乙型肝炎病毒治疗中的双刃剑

人体对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染的免疫应答是一个非常复杂的病理过程,一方面免疫反应能有效清除HBV病毒和被病毒感染的肝细胞,对HBV诱发的肝类疾病有较好的治疗作用;另一方面,免疫反应在清除被感染肝细胞的同时,也引起局部炎症反应,从而损伤正常的肝细胞和组织.其中,特异性免疫T细胞及其产生的细胞因子是这一免疫应答过程的重要参与者.侧重总结了在HBV感染治疗中的关键细胞和分子及激活人体免疫应答治疗中的两面性,为调节自身免疫应答治疗HBV,避免应答不当而引发的肝损伤提供理论基础.     

心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的CREG 蛋白表达载体 的构建及鉴定

目的:构建心肌特异性α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC)启动子启动E1A基因阻遏子(cellular repressorof E1A-stimulated genes,CREG)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合的真核表达载体。绿色荧光蛋白作为报告基因,方便在心肌细胞中直接观察CREG蛋白的表达,为心肌特异性转CREG基因动物模型制备提供载体。方法:用BamH I和EcoR I双酶切pcDNA3.1 myc-His/hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-N1中,构建pCREG-EGFP-N1;根据Genebank中公布的α-MHC基因的启动子序列,人工合成pUC57-α-MHC启动子基因序列,经Ase I和Nhe I双酶切得到启动子α-MHC,亚克隆入pCREG-EGFP-N1中替代原CMV启动子,构建pα-MHC-CREG-EGFP-N1,测序鉴定。用脂质体法将该质粒转染体外培养的小鼠原代心肌细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达。结果:成功构建pα-MHC-CREG-EGFP-N1质粒,酶切及测序结果正确;成功转染入原代培养小鼠心肌细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测到CREG蛋白的表达。结论:重组质粒pα-MHC-CREG-EGFP-N1体外转染入原代培养小鼠心肌细胞后,目的基因能够在心肌细胞中有效表达,检测方法简便可靠,为下一步建立心肌细胞特异性表达CREG的过表达转基因小鼠、深入探讨CREG在心肌疾病发生中的生物学功能研究奠定了基础。     

益生菌与宿主疾病关系的研究进展

人类肠道中含有的多种微生物,称为肠道菌群,它们对宿主的健康起着至关重要的作用。肠道菌群的组成包括细菌、病毒和真核生物,已经被证明与宿主健康有密切的联系,尤其是其中的益生菌。益生菌通过多种途径发挥作用,包括与宿主微生物的相互作用、抵御病原菌的定殖、改善肠道屏障功能、调节免疫功能、产生相关代谢产物,在宿主的代谢、免疫和神经系统中发挥有益作用。综述益生菌的作用机制,讨论了近年来益生菌应用临床研究实例以更好地理解其对疾病风险和健康可持续性的贡献,将为新的治疗干预和疾病预防策略提供参考。     

2株乳酸菌对人工诱发鸡大肠埃希菌病的预防性实验

目的观察植物乳杆菌和粪链球菌2株乳酸菌预防鸡大肠埃希菌病的效果。方法把2株乳酸菌添加到肉鸡的饲料中饲喂,至14日龄时用鸡源致病性大肠埃希菌人工诱发鸡大肠埃希菌病,10 d后统计发病率、死亡率和有效预防率。结果成功诱发出鸡大肠埃希菌病,植物乳杆菌和粪链球菌预防鸡大肠埃希菌病的有效率非常高。结论植物乳杆菌和粪链球菌可以用于预防鸡大肠埃希菌病。     

一氧化氮参与调节盐胁迫诱导的玉米幼苗脱落酸积累

以三叶一心期的玉米幼苗为实验材料,研究了盐胁迫下玉米幼苗根尖和叶片中一氧化氮（NO）和脱落酸（ABA）积累之间的关系。结果表明,盐胁迫下玉米幼苗NO和ABA的含量均增加,用NO供体硝普钠（Sodium nitroprusside,SNP）处理时,ABA含量亦增加,且累积的时间较盐胁迫下早。用NO合成的抑制剂L-NAME （Nω-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride）和NaN,处理时,可减弱盐胁迫诱导的ABA含量的增加,用NO清除剂cPTIO处理时,这种盐胁迫诱导的ABA增加减少。推测盐胁迫下产生的NO参与调节ABA的积累及逆境下植物的防御反应。