苏云金杆菌ZLL13晶体蛋白分析及其菌糠液态培养基的优化

食用菌栽培废料,简称菌糠(spent mushroom substrate, SMS)是食用菌栽培和生产的残留物,其含有丰富的甲壳素、木质纤维和蛋白质等,可为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)的生长提供所需的营养物质。本研究以优化后的前处理条件制备的菌糠浸提液(2%硫酸, 121℃, 1 h)作为主要碳源,通过单因素试验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡和响应面分析等方法来优化最佳培养基组分,结果表明,54%SMS浸提液,31.9 g/L大豆饼粉、0.88 g/L CaCO3、0.4 g/L MnSO4、0.5 g/L K2HPO4和0.4 g/L吐温100为最佳培养基配方,且优化后培养基(1.8×108/mL)产生的孢子数是原始SMS培养基(0.065×108/mL)的27倍,这不仅为菌糠的二次利用提供一种新的有效方法,而且也可以大大降低生产Bt所需要的发酵成本,具有良好的应用前景。     

中华甲虫蒲螨对松墨天牛的生防潜力初探

中华甲虫蒲螨(Pyemotes zhonghuajia Yu, Zhang and He)在多种蛀干害虫中起到了较好的防治效果,但利用其对松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)进行防治的研究目前较少。为揭示中华甲虫蒲螨对松墨天牛的寄生效果,初步探究其生防潜力,比较中华甲虫蒲螨对不同龄期松墨天牛幼虫的寄生情况与致死力,及不同温度对中华甲虫蒲螨发育及寄生效果的影响。结果显示,中华甲虫蒲螨对1龄、2龄、3龄、4龄幼虫均有致死力,致死力强弱为2龄3龄4龄1龄;不同龄期松墨天牛幼虫体上的中华甲虫蒲螨寄生数量差异显著(p0.05),其中2龄幼虫体上寄生的数量最高,达(5.800±1.448)头;2龄、3龄、4龄幼虫体上寄生的蒲螨可产生膨腹体完成世代发育,且3龄虫体上的膨腹体发育最好;蒲螨膨腹体发育的最适温度区间为24℃~28℃,低于或高于此温度区域膨腹体会发育不良或难以发育。综上,中华甲虫蒲螨对松墨天牛幼虫有较好的防治效果,有助于日后松墨天牛的生物防治。     

松墨天牛漆酶基因MaLac1的克隆、原核表达及表达谱分析

【目的】本研究旨在克隆并鉴定松墨天牛Monochamus alternatus内源漆酶基因MaLac1,分析其在松墨天牛不同发育阶段的表达水平,为进一步明确MaLac1功能提供依据。【方法】基于松墨天牛肠道转录组测序数据,通过RACE克隆松墨天牛MaLac1基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;将该基因与pET-32a载体链接构建表达载体pET-MaLac1,导入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3)使其表达;使用qPCR检测MaLac1基因在松墨天牛不同发育阶段(低龄幼虫、老熟幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫)肠道中的表达差异。【结果】克隆获得松墨天牛MaLac1的cDNA全长序列(GenBank登录号:KY073340)。MaLac1开放阅读框全长2 067 bp,编码一个含688个氨基酸的蛋白质,预测分子量为78.34 kD,等电点为5.30。SignalP 4.1 Server预测MaLac1在N端包含一个15个氨基酸的信号肽。序列比对分析表明,MaLac1具有典型的昆虫漆酶基因特征,与赤拟谷盗Tribolium castaneum漆酶基因的氨基酸序列一致性达93%。SDS-PAGE检测发现IPTG诱导表达了一条大约78 kD的特异蛋白条带,与推测大小一致。qPCR结果显示,MaLac1在不同发育阶段的松墨天牛肠道中均有表达,其中,在雌成虫肠道中表达量最高,在雄成虫肠道中的次之,在幼虫肠道中的最低。【结论】MaLac1在松墨天牛成虫中表达量显著高于其在幼虫中的,这一结果可能与幼虫和成虫的取食习性差异相关。MaLac1在松墨天牛体内的功能还有待进一步研究。     

松天牛小首螨对极端温度耐受性的驯化效应及低温存储研究

[目的]松天牛小首螨是近年发现的首个能够寄生致死松墨天牛卵的一个螨类新种,研究该螨对极端温度耐受性的驯化效应和低温存储条件,有助于进一步评估该螨的潜在地理分布或应用区域,并为该螨的规模化运输和存储提供基础依据。[方法]通过不同温度条件驯化后,测定松天牛小首螨暴露在极端温度下的存活率,同时比较不同低温条件下存储的松天牛小首螨膨腹体涌出的成螨数量,以及存储的雌成螨的生存情况。[结果]高温驯化可显著提高雌成螨高温暴露存活率,其中30℃ 36 h驯化后的存活率提高了1.26倍;低温驯化可显著提高雌成螨极端低温暴露存活率,其中10℃ 96 h、10℃ 120 h驯化后的存活率分别提高了2.08和2.13倍。以膨腹体为存储对象,低温存储后涌出成螨的数量随着存储时间延长而逐渐显著减少;以雌成螨为存储对象,在10℃条件下存储30 d,存活率为65.10%,在4℃条件下存储30 d,存活率达84.21%。[结论]松天牛小首螨具有很强的温度适应性,短期温度驯化即可大幅提升其对极端温度的耐受性。膨腹体适合作为该螨短期低温存储对象,雌成螨则适合作为中长期低温存储对象。     

嗜虫耶尔森氏菌HlyA及HasA外分泌表达系统的构建

【目的】构建一株具备外分泌蛋白功能的工程菌,解决杀虫毒素无法由胞内分泌至胞外,无法直接作用于虫体等问题,为松墨天牛防治提供新思路。【方法】本研究先测定从松墨天牛肠道及其生境中分离出的嗜虫耶尔森氏菌(CSLH88)的生长特性及抗性,进而对其进行分子改造。构建HlyA (pGHKW2)以及HasA (pGHKW4)外分泌表达载体,利用电穿孔法将其转入CSLH88菌株,获得能够表达绿色荧光蛋白的工程菌。利用稀释涂板及荧光体式镜检测技术对两个质粒进行遗传稳定性检测,并采用SDS-PAGE及Western blotting技术验证蛋白外分泌功能。【结果】CSLH88菌株培养2–4 h能够进入对数生长期,并对卡那霉素(Kan)敏感。成功构建了含有Kan抗性基因的pGHKW2(GenBank:MK562405)和pGHKW4(GenBank:MK562404)两个外分泌表达载体的CSLH88工程菌株。其中,发现pGHKW4质粒更加适合在嗜虫耶尔森氏菌中稳定遗传。SDS-PAGE及Western blotting检测结果表明HlyA系统无法在CSLH88菌株中将目的蛋白分泌到胞外,而HasA系统则可以有效地发挥外分泌表达功能。【结论】通过对HlyA及HasA两个外分泌表达系统进行研究,从中筛选出HasA型血红素转运系统作为CSLH88菌株的外分泌表达系统,为后续外分泌杀虫毒素蛋白菌株构建以及CSLH88菌株的致病性研究奠定基础。     

棉铃虫人工饲料主要污染细菌鉴定及其抗生素筛选

棉铃虫的人工饲养是对其进行昆虫病原菌生物测定的重要步骤,而饲料污染是影响棉铃虫培养成功率的主要因素。因此,选择合适的抗生素对棉铃虫的饲养具有重要意义。为明确棉铃虫饲料中污染细菌的组成,筛选可抑制污染菌的抗生素,本研究以受污染棉铃虫饲料中分离出的9个菌株为实验材料,观察菌株形态。采用16S rDNA系统发育分析法构建进化树,同时根据药敏与生理生化实验,确定分离菌株的生理生化特性。结果表明,9个菌株共呈现5种生理生化特性,其中,2株与肠球菌属(Enterococcus sp.)接近,2株与埃希氏菌属(Escherichia sp.)接近,2株与志贺氏菌属(Shigella sp.)接近,2株与肠杆菌属(Enterobacter sp.)接近,1株与沙雷氏菌属(Sarratia sp.)接近。抗生素筛选实验结果显示,卡那霉素对于不同菌株的抑菌效果最好。这为提高棉铃虫人工饲养成活率具有重要意义。     

基于多色彩空间的YOLOv5松枯死树检测方法

【目的】针对在松枯死树监测实践中,从无人机航拍RGB影像中自动识别松枯死树漏检率高的问题,提出了一种生产应用场景下基于多色彩空间的YOLOv5松枯死树高精度自动识别新方法。【方法】利用无人机采集大面积松材线虫病发生林分的RGB图像,用Pix4Dmapper软件拼接,用LabelImg开源软件建立VOC格式的松枯死树数据集,分别用Faster R-CNN、YOLOv3、YOLOv4、YOLOv5、SSD和EfficientDet等6种基于深度学习的目标检测算法对数据集进行训练和测试,以精确率、召回率、平均准确率以及F₁分数作为评价指标筛选出最优目标检测算法;然后将采集的RGB图像转换成LAB和HSV色彩空间图像,再将这3个色彩空间的图像分别用最优目标检测算法进行训练,得到目标在每个色彩空间的边界框,使用非极大值抑制算法对这些边界框进行处理,得到最优边界框实现松枯死树自动识别。【结果】6种算法均取得良好效果,其中YOLOv5模型为最优算法,其精准率、平均查准率和F₁分数在6种算法中均最高,分别达到97.58%、82.40%和0.85。通过3个色彩空间融合后,反映漏检情况的召回率由74.54%提高到98.99%,平均准确率提升至98.39%。【结论】基于多色彩空间的YOLOv5模型能够显著提高从无人机航拍RGB影像中检测松枯死树的精度,为松枯死树监测提供了有力工具,也有助于松材线虫病的防治。