心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的CREG 蛋白表达载体 的构建及鉴定

目的:构建心肌特异性α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC)启动子启动E1A基因阻遏子(cellular repressorof E1A-stimulated genes,CREG)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合的真核表达载体。绿色荧光蛋白作为报告基因,方便在心肌细胞中直接观察CREG蛋白的表达,为心肌特异性转CREG基因动物模型制备提供载体。方法:用BamH I和EcoR I双酶切pcDNA3.1 myc-His/hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-N1中,构建pCREG-EGFP-N1;根据Genebank中公布的α-MHC基因的启动子序列,人工合成pUC57-α-MHC启动子基因序列,经Ase I和Nhe I双酶切得到启动子α-MHC,亚克隆入pCREG-EGFP-N1中替代原CMV启动子,构建pα-MHC-CREG-EGFP-N1,测序鉴定。用脂质体法将该质粒转染体外培养的小鼠原代心肌细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达。结果:成功构建pα-MHC-CREG-EGFP-N1质粒,酶切及测序结果正确;成功转染入原代培养小鼠心肌细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测到CREG蛋白的表达。结论:重组质粒pα-MHC-CREG-EGFP-N1体外转染入原代培养小鼠心肌细胞后,目的基因能够在心肌细胞中有效表达,检测方法简便可靠,为下一步建立心肌细胞特异性表达CREG的过表达转基因小鼠、深入探讨CREG在心肌疾病发生中的生物学功能研究奠定了基础。