分子标记技术的发展及应用

介绍了几种应用前景较广的分子标记,如基于DNA杂交技术的分子标记:限制性片段长度多态性(RFLP)和DNA可变串联重复数标记(VNRT);基于PCR技术的分子标记:随机扩增多态性 DNA(RAPD)、酶切扩增多态性(CAPS)、扩增片段长度多态性(AFLP)、微卫星DNA(SSR)和DNA单链构象多态性(SSCP);以及新兴的第3代分子标记,即基于DNA芯片技术的分子标记:单核苷酸多态性(SNP)等。分别阐述了它们的原理、方法步骤与优缺点、应用注意事项和适用范围,同时概述了它们在生物学研究中的应用和进展。     

植酸酶酵母工程菌的构建*

从无花果曲霉(Aspergillus ficuum)3．4322中用RT-PCR方法扩增出一条约1．4kb的特异性条带,DNA序列测定表明,目的片段为不含信号肽的植酸酶编码序列,全长1347bp。无花果曲霉(Aspergillus ficuum)3．4322phyA基因序列已在GenBank注册(注册号为：AF537344)。将该基因克隆到酵母表达载体pYES2中,构建成不带信号肽phyA基因的重组表达载体pYPA2。用醋酸锂法将pYPA2转进urd缺陷型的酿酒酵母(s．oeraisiae INVSc1),筛选获得含植酸酶基因的酵母转化子。经半乳糖诱导表达后,用磷钼蓝显色(AMES)法对酵母菌体进行酶活测定,测出了明显的植酸酶活性,pYPA2胞内植酸酶活性约11．55IU／mL,表明无花果曲霉(Aspergillus ficuum)3．4322phyA基因能在酿酒酵母中表达。     

蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10于大肠杆菌不同载体的可溶性表达策略研究

蒙古黄芪病程相关蛋白（Astragalus membranaceus pathogenesis-related protein-10, AmPR-10）具有核酸酶活性,对黄芪生长发育及抗病机制具有重要意义。但从天然黄芪中提取蛋白质的传统方法成本较高,蛋白得率较少。研究首次利用大肠杆菌表达体系对AmPR-10进行可溶性外源表达,构建了3种重组子：①以pET28a为载体构建pET28a-AmPR-10;②以pET30a为载体构建pET30a-AmPR-10;③以pET30a为载体、大肠杆菌分子伴侣skp修饰构建pET30a-skp-AmPR-10。通过SDS-PAGE分析,目的蛋白可溶性表达量比较结果是：pET30a-skp-AmPR-10 > pET30a-AmPR-10 > pET28a-AmPR-10。由蛋白质三级结构模拟分析发现,载体pET-30a上的标签S-tag通过影响AmPR-10局部α螺旋构象而提高目标蛋白的可溶性表达,分子伴侣skp通过提高融合蛋白整体α螺旋比例进一步提升目标蛋白可溶性表达量。研究解决了目前从天然黄芪中提取蛋白操作复杂、提取量小的问题。同时,经测定,目的蛋白具有核酸酶活性,为外源AmPR-10相关活性研究提供了依据。     

L-茶氨酸对H2O2致L02细胞损伤的保护作用及其机制研究

研究L-茶氨酸对肝细胞损伤的保护作用及其机制。利用H2O2诱导的LO2肝细胞损伤模型,分别用MTT法检测细胞存活率、测定LDH、流式细胞术检测细胞凋亡率、Western blot法检测Caspase-3和PARP蛋白表达7LBax／Bcl-2比值的变化,评价L-茶氨酸是否能保护H2O2诱导的肝细胞损伤。结果表明,L-茶氨酸能提高H2O2损伤的L02细胞存活率,减少LDH的渗漏,降低肝细胞凋亡,且L-茶氨酸通过抑制caspase-3的激活和PARP的切割及Bax／Bcl-2比值的升高而发挥抗凋亡的作用。L-茶氨酸对肝细胞损伤有一定的治疗和保护作用。     

杂交转育植酸酶phyA大豆阳性材料筛选研究北大核心CSCD

植酸及其盐类占土壤非有效态磷30%～40%,利用转基因技术结合常规育种手段培育能够分解利用植酸磷的作物新品种是解决这一问题的最新途径。本研究以农杆菌转化子叶节所获得的JL35-phyA为试材,采用PCR与RT-PCR进行目的基因检测,获得转基因阳性材料;随后将这些阳性材料与38个常规大豆杂交,实现phyA向不同大豆品种的转育。结果表明,利用农杆菌转化技术已将phyA转入吉林35,且基因在大豆根系能够正常转录表达,转基因株系的单株荚数、粒数、粒重及百粒重显著高于野生型,蛋白质和脂肪含量与野生型差异不显著;利用这些转基因株系,通过杂交转育获得F1阳性单株427个,涉及上述38个不同组合,说明目标基因phyA已转移到杂交后代;将F1阳性单株自交后筛选得到部分组合的阳性F2植株及F3子粒,经农艺性状考察,这些后代材料中存在丰富的遗传变异,并在杂交后代中选育出一些转有目标基因的优良株系,为今后培育转phyA大豆新品种(系)提供了一批重要的遗传资源。     

健脾方抗衰老作用的实验研究

中医学认为肾气和脾胃虚衰是人衰老的主要原因之一,而益肾健脾胃为培原固本养生的重要治则。我们应用健脾的中西药组方分组进行老龄Wistar大鼠的实验冶疗。实验结果表明:健脾方能升高SOD(P<0.001),降低血清总胆固醇(P<0.05)增加HDL(г<0.001),和升高HDL/TC比值的作用,并且提高大鼠的耐乏氧(P<0.05)和抗疲劳(P<(?).01)的功能。维生素E则有升高SOD(P<(?).001)和HDL(г<0.001)并提高耐乏氧的作用。腔睥胃有抗衰老的功效。     

蚕类核酸的研究 1.氯仿去污剂法分离纯化蚕类DNA

应用氯仿去污剂的方法,从蚕蛹和幼虫制备DNA,所得DNA制品内没有或者只有微量的RNA和蛋白质。DNA是双链高分子,在蚕类上进行的试验表明这种DNA具有遗传转化作用。     

神经生长因子在雄鸡睾丸组织中的定量表达

为探讨神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)在雄鸡睾丸组织中的表达情况。分别取20 w、24 w、28 w、35 w龄雄鸡睾丸组织,一部分经冻存处理后采用Trizol试剂提取Total RNA。根据GenBank中已公布的原鸡NGF基因序列,利用Primer 5.0设计合成特异性引物,通过两步法RT-PCR扩增出NGF基因片段,然后利用实时荧光定量PCR以β-actin为内参基因进行相对定量分析。另一部分经冻存处理后用RIPA组织裂解液提取总蛋白进行Western blot分析。结果显示两步法RT-PCR扩增出的NGF基因片段经电泳检测为219 bp,符合预期片段大小,与GenBank中登录的鸡NGF基因比对,同源性达99%;NGF基因在不同周龄雄鸡睾丸组织中的mRNA表达水平表现为:性成熟发育期(20 w-28 w)雄鸡睾丸组织NGF mRNA的表达量随鸡龄的增加呈上升趋势,且28 w达到高峰,成年期(35 w)有所下降。Western blot检测到NGF的蛋白表达量随各发育阶段呈增加趋势,在20 w龄前,蛋白表达量处于较低水平,在进入睾丸迅速发育期(20 w-28 w)后,表达量大幅度增加,在35 w基本达到峰值。提示NGF mRNA的表达随着睾丸组织的发生、发育呈现一定的变化规律,且NGF在睾丸组织的发育及精子的发生等阶段起到重要的调节作用,从而为后续研究NGF在禽类生殖系统中的作用提供一定的理论依据。     

中国新记录种——四目小尺蛾(Cyclophora albipunctata griseolata)(Staudinger)

作者在整理沈阳、铁岭地区灯下蛾类时,发现国内新记录一种,记述如下: 四目小尺蛾Cyclophora albipunctata griseolata(Staudinger)中国新记录 翅展21—25毫米,触角雄虫李齿状,雌虫丝状。全体及足均为灰白色。在后足胫节上雄虫有1对距,雌虫有2对距。前翅具径室1个。前、后翅灰白色或略带红色,前、后翅仅外横线隐约可见成列褐色小点。翅中央均有一深褐色环形纹(图1)。雄虫外生殖器见图2。     

微卫星DNA标记及其在鱼类遗传多样性研究中的应用

微卫星DNA作为第二代分子遗传标记是高等真核生物基因组中种类多、分布广、具有高度的多态性和杂合度的分子标记,由于其具有多态性检出率高、信息含量大、共显性标记、实验操作简单、结果稳定可靠等优点,已经成为种群遗传学研究中被广泛应用的分子遗传标记。微卫星DNA标记技术在鱼类的群体遗传结构的分析、物种遗传多样性的鉴定以及遗传基因连锁图谱的构建等方面已初步得到应用。该文就微卫星技术的原理方法,在鱼类遗传多样性研究中的应用概况以及应用范围和注意事项等方面进行综述。为微卫星技术在鱼类遗传多样性研究中应用提供了理论参考。