L-茶氨酸对H2O2致L02细胞损伤的保护作用及其机制研究

研究L-茶氨酸对肝细胞损伤的保护作用及其机制。利用H2O2诱导的LO2肝细胞损伤模型,分别用MTT法检测细胞存活率、测定LDH、流式细胞术检测细胞凋亡率、Western blot法检测Caspase-3和PARP蛋白表达7LBax／Bcl-2比值的变化,评价L-茶氨酸是否能保护H2O2诱导的肝细胞损伤。结果表明,L-茶氨酸能提高H2O2损伤的L02细胞存活率,减少LDH的渗漏,降低肝细胞凋亡,且L-茶氨酸通过抑制caspase-3的激活和PARP的切割及Bax／Bcl-2比值的升高而发挥抗凋亡的作用。L-茶氨酸对肝细胞损伤有一定的治疗和保护作用。     

人谷胱甘肽S-转移酶pi(GSTp)中半胱氨酸对其在细胞氧化应激下功能的影响

利用PCR定点突变技术构建人GSTp三种半胱氨酸突变体C~(47/101)、C~(14/47/101)和C~(14/47/101/169)。将CSTp 野生型和突变体表达质粒转染293细胞,以CDNB 为底物测定胞内GST 的转移酶活性,结果显示各类突变体均明显抑制了细胞内源性CST 的催化活性,具有显著的负显性(dominant nega-tive)突变体的功能;将CSTp 野生型和突变体与c-Jun、NF-kB 和p53的报告基因载体共转染,通过萤光素酶活性测定发现突变体C~(14/47/101)和C~(14/47/101/169)能明显激活c-Jun 和p21的转录活性;Western印迹分析显示突变体均能上调细胞内p21蛋白的水平,细胞存活率的测定表明GSTp 突变体能增强293细胞对H_2O_2刺激的敏感性;实验结果表明半胱氨酸残基对于维持GSTp 在对抗细胞氧化应激过程中的保护作用至关重要。     

耐热嗜酸古细菌Sulfolobus acidocaldarius 谷氨酰胺合成酶的表达调控和性质研究

古细菌Sulfolobus acidocaldarius细胞内谷氨酰胺合成酶的表达量随着培养条件的改变有较大差异,RNA印迹表明,该差异是在mRNA水平受到调控.经DEAE-Sepharose和Sephacryl S-300两步分离酶蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和凝胶过滤测定分子质量,表明该酶为12个相同亚基组成,分子质量为630 ku的多聚体.该酶的最佳pH为7.3;对羟胺、谷氨酰胺、ADP和Mn²⁺的K_m值分别为3.5 mmol/L、1.3 mmol/L、0.15 mmol/L和0.24 mmol/L;其γ-谷氨酰转移酶活性和生物合成酶活性的最佳温度均为90℃.Arrhenius曲线表明,γ-谷氨酰转移酶的活化能为47 kJ/(mol·K),生物合成酶的活化能分别为29 kJ/(mol·K)（40～75℃）和10 kJ/(mol·K)（55～90℃）.对该酶的抑制剂研究发现,与其他来源的谷氨酰胺合成酶不同,甘氨酸、L-丙氨酸能明显抑制 S.acidocaldarius谷氨酰胺合成酶的活性,而常规的抑制剂如L-色氨酸、L-组氨酸、5′-AMP却没有抑制作用,甘氨酸、L-丙氨酸的抑制作用为竞争性抑制,推断该酶的活性调节与绝大多数革兰氏阳性菌一样不受腺甘酰化的影响.     

人谷胱甘肽S-转移酶pi（GSTp）中半胱氨酸对其在细胞氧化应激下功能的影响

利用PCR定点突变技术构建人GSTp三种半胱氨酸突变体C^47/101、C^14/47/101和C^14/47/101/169。将GSTp野生型和突变体表达质粒转染293细胞,以CDNB为底物测定胞内GST的转移酶活性,结果显示各类突变体均明显抑制了细胞内源性GST的催化活性,具有显著的负显性(dominant negative)突变体的功能;将GSTp野生型和突变体与c-Jun、NF-κB和p53的报告基因载体共转染,通过萤光素酶活性测定发现突变体C^47/101和C^14/47/101/169能明显激活c-Jun和p21的转录活性;Western印迹分析显示突变体均能上调细胞内p21蛋白的水平,细胞存活率的测定表明GSTp突变体能增强293细胞对H202刺激的敏感性;实验结果表明半胱氨酸残基对于维持GSTp在对抗细胞氧化应激过程中的保护作用至关重要。     

谷胱甘肽S—转移酶π通过抑制ASK1—MKK7—JNK通道保护血清撤离诱导的293细胞死亡

谷胱甘肽S－转移酶π（gluatahione S-rtansferaseπ,GSTπ）通过消除细胞内的氧化应激（oxidative stress)来保护细胞免于死亡。为了阐明细胞内GSTπ保护细胞的机制,建立了血清撤离（serum depletion）诱导细胞凋亡的模型。用凋亡信号调节激酶（apoptosis siganl-regulating kinase1,ASK1）和GSTπ cDNAl转染293细胞,来研究GSTπ对ASK1激酶活性及其对下游激酶MKK7和JNK活性的影响及对细胞死亡的保护作用;使用负显性（dominant negative)JNK突变体转染293细胞,来探讨阻断JNK通路对细胞死亡的抑制作用。结果发现GSTπ的细胞内表达可明显抑制的ASK1激活呈剂量依赖性抑制效应,对MKK7和JNK也具有明显的抑制作用;GSTπ的细胞内表达可明显抑制血清撤离带来的细胞死亡;用JNK无活性突变体转染断JNK通路,对血清撤离引起的细胞死亡有明显的抑制作用,抑制率达15％。表明GSTπ对血清撤离引起的细胞损伤的保护机制是通过抑制ASK1－MKK7－JNK通路而发挥作用的。     

分子伴侣grp75在缺糖损伤细胞恢复中的作用

葡萄糖调节蛋白75(grp75)属于热休克蛋白70家族中的一员,细胞中葡萄糖水平下降时(类似于缺血),grp75表达增高。为研究grp75在缺糖及缺糖再灌注条件下对细胞的作用,本文以中国仓鼠肺细胞株CHL为材料,采用脂质体介导的方法,以grp75表达载体pcDNA3/grp75转染CHL细胞,获得过表达grp75的细胞克隆;置于无糖培养基培养20h及无糖培养12h换含糖培养基继续培养8h(缺糖再灌注)或含糖培养20h,运用MTT法、LDH测定和流式细胞术分析等方法评估细胞损伤程度。MTT测定显示,未转染细胞缺糖再灌流的增殖能力比完全培养20h增殖能力明显降低(p<0.05),且低于无糖培养20h(p<0.05),转染细胞缺糖再灌流的增殖能力明显高于对照组(p<0.01);LDH测定结果显示,未转染细胞缺糖再灌流LDH释放百分比显著高于完全培养20h(p<0.01),与无糖培养20h无明显差别(p>0.05),转染细胞缺糖再灌流LDH释放百分比显著低于对照组(p<0.01);流式细胞术分析表明,转染细胞的凋亡率明显低于对照组。以上结果表明grp75过表达的细胞在缺糖损伤细胞的恢复中具有一定强度的抗损害作用。     

关于IL-10抗炎机制的研究

IL-10属于细胞因子中的干扰素家族,研究发现内源性和外源性的IL-10均能在转录水平上强烈抑制IL-1、IL-6、IL-8肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、GM-CSF、G-CSF的合成.近十年来,研究认为IL-10主要是通过抑制IKK的激活或NF-κB的DNA结合能力,从而抑制NF-κB启动相关前炎症因子基因的转录.但同时,国外也报道过IL-10抑制炎症细胞因子如TNF-α的合成可能与NF-κB无关,而与如AP-1,细胞因子信号抑制子-3(SOCS-3)等其他蛋白相关.另一方面,最近随着对NOD家族成员NOD2及其同源异构体的深入研究,有证据表明IL-10对NF-κB的作用可能不仅仅局限在IKK(IκB的激酶)及其下游的水平上,而在上游也会造成影响.     

谷胱甘肽S-转移酶Pi在MAPK途径中的调节作用

谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)是细胞内降解生物异源物质(xenbiotics)的一类酶,GSTπ／GSTpi／GSTp是人体内的一种重要活性亚型;有丝分裂原激活的蛋白激酶(mitogen—activated protein kinase,MAPK)途径能够调节真核细胞凋亡、增殖、分化和应激。1999年国际上首次报道GSTpi能够在MAPK信号途径中起调节作用,其作用机制如下：在正常生长条件下,GSTpi以单体形式与JNK(c—Jun N—terminal kinase)形成复合物,抑制JNK活性;UV照射或H2O2处理细胞后,GSTpi自身形成二聚体／多聚体,导致GSTpi—JNK复合物解离,JNK的抑制被解除,JNK被磷酸化激活后激活转录因子c—Jun,c—Jun的激活能进一步促进GSTpi基因的转录,进而合成新的GSTpi蛋白单体,该单体又能反馈抑制JNK。后续研究发现GSTpi也能够抑制JNK激酶的上游激酶ASK1的活性。上述研究揭示GSTpi酶在细胞内除能通过降低异源物质而改变细胞的ROS平衡外,其蛋白本身还具有特异性地抑制MAPK信号转导途径中JNK激酶和JNK上游激酶的新功能。     

基因工程酶法结合酵母能量耦联高效合成L-谷氨酰胺的研究

通过PCR方法从Bacillus subtilis基因组DNA中扩增出谷氨酰胺合成酶基因(glnA),克隆至表达载体pET28b, 经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3), 用IPTG及乳糖诱导表达。 SDSPAGE分析表明,所表达的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase ,简称GS)为可溶性蛋白,约占总菌蛋白的80％。利用表达的GS蛋白 N端的6×HisTag 对GS进行亲和层析,将获得的纯蛋白进行酶活性测定。结果表明,纯化的GS合成反应的最适温度为60℃,最适pH为6.5,Mn²⁺能明显提高GS的活性和稳定性。工程菌BL21(DE3)/pET28b-glnA粗提物中GS的比活是宿主菌本身的84倍。以谷氨酸、NH₄Cl和ATP为底物的转化实验表明谷氨酸的转化率达95％以上。 经筛选获得一株高效能量耦联酵母菌株,命名为YC001;通过能量耦联表明,该系统对谷氨酸的转化率高达80％,平均谷氨酰胺产量为22g/L。