"两步法"体外培养山羊卵母细胞的超微结构观察

有假说认为,卵母细胞在体外培养过程中,如果延长GV期,可促进卵母细胞进一步成熟,因而提高发育潜能。采用山羊半卵泡和卵母细胞共培养,抑制卵母细胞GVBD发生,从而延长GV期。比较了共培养前后和恢复成熟培养后卵母细胞的超微结构变化,其目的从亚细胞水平寻找卵母细胞进一步成熟的证据。研究发现,常规成熟培养:有卵周隙存在,但不贯通,局部区域卵膜与透明带结合紧密;部分皮质区尚有细胞器存在;微绒毛大部分从透明带中撤出,倒伏于质膜表面,数量较多,形态较为粗大;皮层颗粒质膜下部分单层分布,部分散布于皮质区;线粒体均匀散布于卵质中央区。共培养前:卵母细胞的卵周隙尚未形成,微绒毛没有从透明带中撤出;线粒体等细胞器分布于皮质区,皮层颗粒成簇状分布,皮质区富含细胞器。共培养后:局部形成卵周隙,微绒毛已自透明带中撤出,数量较多,垂直或倒伏于卵膜表面;线粒体以簇状分批开始内移,皮层颗粒已部分单层分布于质膜下,部分皮质区缺乏细胞器。恢复成熟培养后:卵周隙进一步扩大并且贯通,微绒毛数量减少并且绝大多数垂直于卵膜;线粒体在卵质中央区均匀分布,皮层颗粒卵膜下单层分布,大部分皮质区无细胞器存在。利用“两步法”培养得到的卵母细胞与体外常规成熟培养的卵母细胞相比,更有利于皮层颗粒的质膜下单层分布,卵母细胞卵周隙的形成与贯通,微绒毛数量减少和垂直于卵膜表面,无细胞器皮层区的进一步形成。因此,更有利于卵母细胞胞质的进一步成熟。     

转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点的研究

主要采用了绝对定量PCR和热不均一交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR),检测了体细胞核移植技术生产的绿色荧光蛋白转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点,并利用旁侧PCR(Junction PCR)对整合位点进行确定,同时进一步分析了整合位点的纯合性．结果表明,绝对定量PCR可以准确有效地检测外源基因拷贝数,标准曲线为：log₂N (拷贝数) =-0.935 4ΔCt + 3.411 6 (R²=0.997 4,P < 0.001),两只转基因猪中外源基因拷贝数分别为30.85 ± 1.77和18.87 ± 1.34;TAIL-PCR能成功地克隆转基因猪中外源基因整合位点,得到25条特异性条带,经BLAST比对,共获得TgInS1 (1 440 bp)、TgInS2 (1 263 bp)和TgInS3 (1 861 bp) 3个整合位点．以整合位点侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合引发Junction PCR,得到预计大小的特异性片段,确定了整合位点上、下游侧翼序列的准确性．采用整合位点5′上游和3′下游侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合,进行Junction PCR,在两只转基因猪中都得到与野生型猪一致的侧翼序列特异性引物扩增片段,表明我们获得的转基因猪都为整合位点杂合子．初步建立了绝对定量PCR和TAIL-PCR对外源基因拷贝数和整合位点检测的体系,为今后研究外源基因在转基因猪中遗传和表达的稳定性打下了基础．     

肠绒毛消化法所得仔猪小肠上皮细胞的培养与鉴定

小肠上皮细胞作为肠道的主要功能细胞,在多种肠道疾病和上皮间质转化的研究中发挥着重要的作用。采取组织块消化和肠绒毛消化两种方法对新生仔猪小肠上皮细胞进行分离培养,传代后通过细胞形态学及免疫荧光等方法对其进行鉴定,结果表明:肠绒毛消化法所获得的小肠上皮细胞要远好于组织块消化法所得细胞,细胞在24～48h贴壁,呈现出典型的三角形或多角形样,10～12d细胞汇合成片、单层生长、互不重叠;细胞角蛋白18(cytokeratin-18)和尾型同源盒基因2(Cdx2)阳性,碱性磷酸酶检测阴性,扫描电镜下可以清楚地看到均匀分布的肠绒毛。以上结果表明,该实验成功建立出可连续传代并符合小肠上皮细胞鉴定标准的仔猪小肠上皮细胞。     

神经营养因子在阿尔茨海默病中的作用及应用现状

神经营养因子是一类机体内分泌的,为神经元发育、生长及分化所必需的蛋白质。在整个生命过程中,神经营养因子对中枢及周围神经系统中神经元功能特性的表达、维持突触的生长及可塑性、防止神经元受损及凋亡及改善已受损神经元修复均具有重要的调控作用。结合神经生长因子与脑源性神经生长因子研究现状,主要介绍神经生长因子与脑源性神经生长因子在阿尔茨海默病中的作用及机理研究进展,总结神经营养因子在阿尔茨海默病临床应用的现状,最后分析预防和治疗阿尔茨海默病新手段的研究方向。     

地衣芽孢杆菌WS-6 β-葡聚糖酶基因的克隆及表达

β-葡聚糖是植物细胞壁中结构性非淀粉多糖,存在于各种饲料农作物中。作为一种抗营养因子,β-葡聚糖使食糜具有很高的粘度,阻碍肠道消化液与食糜的混合,影响营养物质特别是蛋白质和脂肪的消化吸收,降低饲料的利用率。地衣芽孢杆菌分泌的β-葡聚糖酶可分解β-葡聚糖。在青贮发酵过程中,这种酶可降解大麦β-葡聚糖,有效提高家畜、家禽对饲料的利用率。从地衣芽孢杆菌WS-6中克隆到β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因并进行测序,将该基因与大肠杆菌表达载体pET32a进行连接,转化大肠杆菌BL21,使该基因得到了有效的表达,为进一步在食品级宿主菌中的表达奠定了基础。     

猪卵母细胞c-mos基因表达以及RNA干扰

c-mos基因在动物卵母细胞减数分裂调控中起作用,但其作用机制目前仍不清楚。本实验通过RT-PCR、免疫荧光激光共聚焦检测方法检测了猪卵母细胞在体外成熟培养过程中c-mos基因在转录水平、翻译水平上的表达以及蛋白的分布,并应用注射小干扰RNA(siRNA)方法对其进行了RNA干扰(RNAi)研究。结果显示,猪卵母细胞在体外成熟培养过程中c-mos基因mRNA量逐渐增高,电激活后6h接近完全降解;MOS(c-mos基因蛋白产物)在GV卵母细胞生发泡中有一定量的表达,生发泡破裂(GVBD)前表达量增加且开始向卵母细胞胞质弥散,成熟培养44h未成熟卵母细胞中的MOS表达量要高于成熟卵母细胞,激活后6h核区MOS明显减少,但仍然有少量MOS分布于胞质中;成熟培养前干扰c-mos基因,所用三个siRNA都能成功敲低mRNA量,分别是同时期对照组mRNA量的0.08±0.03,0.11±0.06和0.20±0.06倍,干扰后虽然没有完全剔除MOS,但MOS量比同期卵母细胞有明显下降,仍可以引发成熟卵母细胞染色体解凝集。研究结果揭示了猪卵母细胞体外成熟及发育进程中c-mos基因在转录和翻译水平上的动态表达规律,建立了猪卵母细胞c-mos基因RNAi体系,为MOS在猪卵母细胞发育过程中的功能研究建立了重要的基础。     

低温对沙葱萤叶甲越冬卵存活和发育的影响

【目的】沙葱萤叶甲Galeruca daurica(Joannis)是近年来在内蒙古草原暴发成灾的一种新害虫,以卵在牛粪、石块及草丛下越冬,了解其越冬卵的抗寒能力有助于预测其分布范围及种群数量动态。【方法】在室内测定了沙葱萤叶甲越冬卵在不同低温条件下(-18~-39℃)暴露12和24 h及在-30℃低温条件下暴露不同时间(0~60 d)的存活率以及存活卵的发育历期。【结果】低温强度和暴露时间对沙葱萤叶甲越冬卵的存活率有显著影响,随着温度的降低和暴露时间的延长,越冬卵的存活率降低。当温度≤-33℃暴露12 h或≤-30℃暴露24 h,越冬卵存活率显著低于其相应的对照(25℃)。越冬卵低温暴露12和24 h的致死中温度(LT50)分别为-33.08和-32.13℃,在-30℃下的致死中时间(Lt50)为33.33 d。经-36℃低温暴露12 h或≤-33℃低温暴露24 h后,存活的越冬卵发育历期显著延长,而-30℃低温暴露30 d内差异不显著。【结论】沙葱萤叶甲越冬卵抗寒能力强,冬季低温通常不会造成越冬卵的大量死亡。     

“两步法”体外培养山羊卵母细胞的超微结构观察

有假说认为,卵母细胞在体外培养过程中,如果延长GV期,可促进卵母细胞进一步成熟,因而提高发育潜能。采用山羊半卵泡和卵母细胞共培养,抑制卵母细胞GVBD发生,从而延长GV期。比较了共培养前后和恢复成熟培养后卵母细胞的超微结构变化,其目的从亚细胞水平寻找卵母细胞进一步成熟的证据。研究发现,常规成熟培养：有卵周隙存在,但不贯通,局部区域卵膜与透明带结合紧密;部分皮质区尚有细胞器存在;微绒毛大部分从透明带中撤出,倒伏于质膜表面,数量较多,形态较为粗大;皮层颗粒质膜下部分单层分布,部分散布于皮质区;线粒体均匀散布于卵质中央区。共培养前：卵母细胞的卵周隙尚未形成,微绒毛没有从透明带中撤出;线粒体等细胞器分布于皮质区,皮层颗粒成簇状分布,皮质区富含细胞器。共培养后：局部形成卵周隙,微绒毛已自透明带中撤出,数量较多,垂直或倒伏于卵膜表面;线粒体以簇状分批开始内移,皮层颗粒已部分单层分布于质膜下,部分皮质区缺乏细胞器。恢复成熟培养后：卵周隙进一步扩大并且贯通,微绒毛数量减少并且绝大多数垂直于卵膜;线粒体在卵质中央区均匀分布,皮层颗粒卵膜下单层分布,大部分皮质区无细胞器存在。利用“两步法”培养得到的卵母细胞与体外常规成熟培养的卵母细胞相比,更有利于皮层颗粒的质膜下单层分布,卵母细胞卵周隙的形成与贯通,微绒毛数量减少和垂直于卵膜表面,无细胞器皮层区的进一步形成。因此,更有利于卵母细胞胞质的进一步成熟。     

血清及BSA对牛体外受精胚胎发育过程超微结构影响的研究

本研究将牛IVF胚胎分别在SOF FCS、SOF BSA和SOF PVA三种培养系统内进行培养,然后分别取三个系统中发育到原核期、2细胞、4细胞、8细胞、桑椹胚和囊胚阶段的胚胎进行透射电镜的观察,了解培养系统中血清和BSA的添加与否对胚胎发育过程中细胞内脂滴、细胞连接、细胞凋亡和微绒毛发育的影响。观察结果表明：各培养系统胚胎的细胞质中均存在大量的脂滴,表明外培养系统是造成脂滴积累的主要原因;血清的添加不会进一步促进脂滴的大量积累,反而可以避免多个脂滴聚合成更大的脂滴。三种培养系统条件下胚胎细胞连接无显著差异。培养系统中添加FCS或BSA时,桑椹胚期以后的胚胎细胞中存在凋亡小体,表明血清成分是引起细胞凋亡的重要原因。培养系统中血清成分的缺乏会影响胚胎表面微绒毛的发育。