转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点的研究

主要采用了绝对定量PCR和热不均一交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR),检测了体细胞核移植技术生产的绿色荧光蛋白转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点,并利用旁侧PCR(Junction PCR)对整合位点进行确定,同时进一步分析了整合位点的纯合性．结果表明,绝对定量PCR可以准确有效地检测外源基因拷贝数,标准曲线为：log₂N (拷贝数) =-0.935 4ΔCt + 3.411 6 (R²=0.997 4,P < 0.001),两只转基因猪中外源基因拷贝数分别为30.85 ± 1.77和18.87 ± 1.34;TAIL-PCR能成功地克隆转基因猪中外源基因整合位点,得到25条特异性条带,经BLAST比对,共获得TgInS1 (1 440 bp)、TgInS2 (1 263 bp)和TgInS3 (1 861 bp) 3个整合位点．以整合位点侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合引发Junction PCR,得到预计大小的特异性片段,确定了整合位点上、下游侧翼序列的准确性．采用整合位点5′上游和3′下游侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合,进行Junction PCR,在两只转基因猪中都得到与野生型猪一致的侧翼序列特异性引物扩增片段,表明我们获得的转基因猪都为整合位点杂合子．初步建立了绝对定量PCR和TAIL-PCR对外源基因拷贝数和整合位点检测的体系,为今后研究外源基因在转基因猪中遗传和表达的稳定性打下了基础．     

猪VHL基因克隆及敲低克隆胚胎的构建

通过在细胞和胚胎水平对猪Von Hippel-Lindau(VHL)基因进行了基因敲低研究,以便为建立VHL疾病模型猪奠定基础.研究首先通过 3'RACE和5'RACE克隆得到猪VHL基因cDNA全长序列(2 725 bp),Real-time PCR结果表明VHL基因广泛表达于猪的各种组织器官,其中在肾上腺、肝脏、胰腺、心脏和睾丸等组织器官高量表达.进一步在猪iPS细胞中对5条干扰片段进行筛选,获得2条高效的干扰片段,干扰效率分别达到72％(P=0.0012)和64％ (P＜ 0.01).以稳定干扰VHL基因的猪胎儿成纤维细胞为核供体,构建克隆胚胎,结果表明,克隆胚胎的发育能力与对照组相比没有明显差异,而且在克隆囊胚中VHL基因的干扰效率达到71％ (P＜ 0.01).综上所述,文中获得了猪VHL基因全长序列并获得该基因稳定敲低的猪细胞和胚胎,从而为VHL疾病模型猪的构建奠定了良好的基础.     

基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术研究进展*

基于CRISPR/Cas系统出现的单碱基编辑技术可以实现高效且简便的单个碱基的替换编辑,其原理是将胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)或腺苷脱氨酶(adenosine deaminase)与Cas9n(D10A)形成融合蛋白,通过CRISPR/Cas精准识别和定位DNA上的靶位点后,利用胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶将靶点距离sgRNA位点基序(protospacer adjacent motif,PAM)序列端的4~7位的单个碱基发生单碱基转换或颠换。对基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术发现的历史、组成和分类、工作原理进行了概述,并总结了该系统最新进展及应用。     

基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术研究进展*

基于CRISPR/Cas系统出现的单碱基编辑技术可以实现高效且简便的单个碱基的替换编辑,其原理是将胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)或腺苷脱氨酶(adenosine deaminase)与Cas9n(D10A)形成融合蛋白,通过CRISPR/Cas精准识别和定位DNA上的靶位点后,利用胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶将靶点距离sgRNA位点基序(protospacer adjacent motif,PAM)序列端的4~7位的单个碱基发生单碱基转换或颠换。对基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术发现的历史、组成和分类、工作原理进行了概述,并总结了该系统最新进展及应用。     

鸡基因组研究新进展

鸡基因组测序草图的完成标志着禽类功能基因组时代的到来。鸡不仅是全世界广泛饲养且有重要经济价值的禽类,而且是极具生命科学研究价值的模式动物。因此,鸡基因组测序草图的完成将对遗传育种和生物学研究有重要的影响。本文综述了近年来鸡基因组研究的最新进展,主要内容包括鸡基因组的有关数据、物理图谱、遗传连锁图谱、比较基因组学、序列表达标签、生物信息学等方面所取得的成绩,同时对鸡基因组研究结果的应用前景进行了展望。     

猪sall4b基因的克隆及表达分析

sall4基因是sall基因家族的一个成员,在胚胎发育、器官形成和干细胞多能性的维持以及重建中都起到重要作用,有sall4a和sall4b两种剪切突变体类型。目前猪的sall4基因序列尚未获得。鉴于其在多能性细胞调控中的作用,对猪的sall4基因进行了克隆测序,并对其在各组织及胚胎中的表达进行了初步研究。通过5和3 RACE克隆得到猪sall4基因cDNA全长序列(2 372 bp),序列分析证明此基因编码的蛋白结构更接近于小鼠和人Sall4B亚型,同源性可达70%～80%,而与其他物种的Sall4A相比则缺少一段含锌指结构域的片段,同源性降至30%～55%。Real-time PCR证明猪sall4b基因广泛表达于猪的各种器官,其中除卵巢组织呈高量表达之外,脾、肺、心和睾丸表达量也相对较高;在早期胚胎发育过程中除4-细胞阶段相对表达量较低,其他阶段呈高量表达。免疫荧光跟踪Sall4在猪早期胚胎中的表达情况发现Sall4在着床前胚胎中全程表达并定位于细胞核中,在囊胚阶段基因表达趋向于定位在内细胞团中。表达分析证明sall4b基因与多能性紧密相关,预示着猪sall4b基因将可能作为新的重编程因子用于诱导猪多能干细胞的体系中。     

猪Nanog基因四环素诱导干扰载体的构建和鉴定

Nanog基因是在早期胚胎和干细胞等多能性细胞中特异表达的重要基因,但有关猪Nanog基因功能的相关研究甚少。四环素诱导干扰载体是一种可通过四环素等药物条件性诱导干扰目的基因的载体,尤其适用于在发育过程中起着关键作用的基因沉默。常规的四环素干扰系统为二元载体,与一元载体相比获得针对特定基因干扰的稳定细胞系所需周期更长。首先通过构建pGenesil 1.0-shRNA重组干扰载体,瞬时转染稳定过表达猪Nanog基因的猪胎儿成纤维细胞后通过Realtime-PCR筛选出干扰效率可达80%以上的干扰片段。之后将筛选得到的干扰片段插入到改造的一元四环素诱导干扰载体TREsilencer,对稳定表达猪Nanog基因的猪胎儿成纤维细胞进行了瞬时转染。实验分别通过光密度检测以及Realtime-PCR检测了不同浓度doxycycline的诱导效率和干扰效率。结果表明,所构建的四环素诱导干扰载体TREsilencer-shRNA5随着四环素浓度的增加,诱导Nanog基因的干扰效率增加,在处理浓度为1μg/ml时干扰效率可达70%以上,为后续得到可诱导的稳定干扰猪Nanog基因的细胞系和进一步研究猪Nanog基因功能奠定了基础。