Bac-to-Bac系统在杆状病毒功能基因研究上的应用

利用Bac-to-Bac系统,在大肠细菌中复制增殖杆状病毒质粒bacmid,并通过RecA介导法、ET-recombination法在bacmid DNA上缺失或插入功能基因,构建功能基因缺陷型或补回型的杆状病毒质粒.该质粒转染到昆虫细胞中产生重组病毒,进而在细胞甚至虫体水平上研究基因的功能,极大改善了传统上用空斑实验筛选重组病毒的不足.     

人HAS3启动子的结构与功能初步分析

透明质酸合酶3（hyaluronan synthase 3,HAS3）,是一个参与透明质酸合成的酶分子,在上皮形成和肿瘤转移等过程中起重要作用.为了进一步研究HAS3基因的转录调控机制,本研究克隆鉴定了HAS3基因的启动子.首先应用5′RACE（rapid amplification of cDNA ends,cDNA末端快速扩增）技术鉴定了HAS3基因的转录起始位点,发现了丰度和转录起始位点不同的两种新的HAS3基因剪接变异体.通过PCR定向克隆策略,构建了覆盖HAS3基因5′端侧翼区起始密码子ATG上游约4.3 kb区域的一系列HAS3基因启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,HAS3基因启动子定位于转录起始位点附近约450 bp的区域内.转录因子结合位点分析表明,HAS3基因启动子缺乏典型的TATA盒,但含有典型的GC盒以及C/EBP等其它潜在的转录因子结合位点. 结果提示,Sp1和C/EBP等转录因子可能参与HAS3基因的转录调控.     

从绿藻礁膜（Monostroma nitidum Wittr）分离半乳糖专一的凝集素

礁膜（Monostroma nitidum Wittr）经 25%～80%硫酸铵分级、DEAE-纤维素52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析,得到纯化礁膜凝集素（Monostroma nitidum lectin,MNL）,在SDS-PAGE上显示单一蛋白染色带. 用Sephadex G-200层析测得其分子质量为66.6 kD, 用SDS-PAGE测得其分子质量为66.2 kD．该凝集素可以凝集人A、B、AB、O型红细胞,且凝集活性相同. 在对人（A、B、AB、O）、兔、鲤、鲫、鼠、羊、鸡、狗的红细胞凝集作用中,兔凝集作用最强．该凝集素在pH 4.00～10.53范围内均有活性,但在pH 5.20～9.40范围内活性最大．经100 ℃热处理30 min后,该凝集素对兔红细胞血凝活性保留25%,活性最大的温度范围为25～55 ℃．MNL被EDTA抑制,最小抑制浓度为3.13 mmol/L,但对 Ca^２＋和Mg^２＋不敏感．该凝集素凝集兔红细胞的作用不被D -果糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、γ-球蛋白、牛甲状腺球蛋白所抑制,但被D- 半乳糖和乳糖抑制,最小抑制浓度分别为5 mmol/L和2.5 mmol/L．     

视黄酸X受体α促进猪前体脂肪细胞分化

采用细胞转染、油红O染色、油红O染色提取法、GPDH活性测定、semi-qRT-PCR等方法研究了视黄酸X受体α (retinoic acid X receptor α, RXRα)在猪原代前体脂肪细胞分化中的作用及其机理.结果表明,转染pRXRα-EGFP促进了猪前体脂肪细胞RXRα 的表达,脂肪细胞分化能力随之增强, 脂肪细胞GPDH活性、分化转录因子PPARγ和C/EBPαmRNA表达水平均显著升高(P<0.05). 结果提示,RXRα可能通过调控过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ, PPARγ)和CAAT/增强子结合蛋白家族（CCAAT/enhancer binding proteins, C/EBP）C/EBPα 基因表达变化促进猪前体脂肪细胞分化.     

B类1型清道夫受体表达调控与信号转导通路

B类1型清道夫受体(scavenger receptor class B type 1,SR-B1)是一种与清道夫受体CD36具有高度同源性的膜糖蛋白,其表达相对广泛且有着众多生物学作用.体内外多种因素可从转录或转录后水平对SR-B1表达进行调控： PPARα/γ激动剂、部分LXR激动剂、LH/HCG、雌激素等能上调SR-B1的表达;维生素E、INFα、脂多糖、IGF-1、胆酸、PXR激动剂及高糖水平等能下调SR-B1的表达;而血管紧张素Ⅱ则可对SR-B1的表达进行双向调节,且它们具体的调节机制复杂.SR-B1作为一种具有多配体结合特性的膜受体,不同配体与其结合后可介导细胞内不同信号事件及生物学效应,如介导HDL激活细胞内PI3K/Akt及MAPK信号途径, 增加内皮型一氧化氮合酶的磷酸化、促进内皮细胞迁移与内皮重构.此外,非HDL类配体如LDL激活p38MAPK途径、凋亡细胞、血清淀粉样蛋白A等激活胞内MAPK途径均可由SR-B1介导.本文对近年来B类1型清道夫受体表达调控机制及信号转导通路的相关研究进行综述.     

花生四烯酸代谢相关酶和ERK与乳腺癌转移关系

花生四烯酸代谢相关酶环加氧酶(COX)、脂氧合酶(LOX)和活化的胞外信号调节激酶（p-ERK1/2）等与乳腺癌发生发展具有密切关系.为了进一步阐明它们在乳腺癌转移中的作用及其分子机制,应用反转录PCR（RT-PCR）、免疫印迹和免疫组化等方法,分别检测了乳腺癌细胞系、乳腺癌组织、癌旁组织和转移淋巴结组织中COX-2、5-LOX、12R-LOX、cPLA2和p-ERK1/2的表达水平.结果显示,与对照组相比,在具有高转移潜能的乳腺癌LM MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞以及转移淋巴结组织中,COX-2、5-LOX、12R-LOX、cPLA2和p-ERK1/2均有较高水平表达.进而发现,p-ERK1/2的特异性抑制剂PD98059可拮抗LM-MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中COX-2、5-LOX、12R-LOX和cPLA2的高表达.上述结果表明,p-ERK1/2可以通过促进花生四烯酸代谢相关酶的表达促进乳腺癌细胞发生转移.     

调节猪TNF-α表达的miRNAs鉴定

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是脂肪细胞的分泌产物之一,在脂肪中行使着复杂的调节功能,为了研究猪脂肪组织中TNF-α的表达受到哪些miRNA的调控,从猪脂肪组织基因组中获得猪TNF-α3'端非翻译区(UTR)序列,与荧光素酶质粒PGL3-control连接构建猪TNF-α的萤光素酶表达质粒PGL3-TNF-α3'UTR。生物信息学预测miR-19a,miR-124,miR-130a,miR-301,miR-506等miRNAs均靶向猪TNF-α,将这些miRNA分别与PGL3-TNF-α3'UTR质粒共转到细胞中,以乱序序列作为阴性对照(NC),检测miRNA对质粒荧光素酶活性的作用。结果发现miR-19a,miR-124和miR-130a均能够显著抑制萤光素酶的活性(P0.01),为了验证这3个miRNA是否通过各自种子序列起调控作用,突变了PGL3-TNF-α3'UTR中这3个miRNA种子序列的结合位点,结果发现miRNAs对突变质粒中的荧光素酶均无明显抑制作用(P0.05)。结果证明,miR-19a,miR-124和miR-130a与猪TNF-α均有直接的靶向关系并通过各自种子序列抑制TNF-α的表达。     

冬虫夏草研究进展

冬虫夏草是一种名贵的药用真菌 ,由于其自身独特的药用价值而成为各国研究的热点。其生物学特性、化学成分已经阐明 ,从先前的天然采集到现在的菌体人工培养 ,这种根本性的过渡也极大丰富了它的产量和应用。目前对其药用机理已研究清楚 ,药用范围也十分广泛。挖掘和开发这一名贵中药 ,在我国乃至世界医药上均具有十分重要的意义。     

中国部分地方鸡种B-LⅡβ(β_1外显子)基因分子遗传多态性研究

应用ＰＣＲ－ＲＦＬＰｓ方法对１０个鸡种的Ｂ－ＬⅡβ（β１外显子）基因进行分子遗传多态性研 究,综合４种限制性内切酶的酶切情况,共检测到３７种基因组合型,并且在个体间以及品种间 的基因型频率、基因组合型频率都存在较大的差异。同时各酶切位点的Ｈａｒｄｙ－Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡状态在品种上也表现不一致。克隆测序结果表明：β１外显子分子遗传多态性更多地体现在氨 基酸水平,作为抗原结合区,其丰富的多态性与抗原多样性相一致。     

MiR-130a 在猪皮下脂肪细胞分化中的调节作用

为研究miR-130a对猪皮下脂肪细胞分化的影响及可能机制,本试验分离猪皮下脂肪前体细胞,诱导分化为成熟脂肪细胞,检测脂肪细胞分化过程中脂滴变化及miR-130a及其可能靶基因TNF α和PPARγ的表达模式.同时合成miR-130a mimics及inhibitor 对细胞进行转染,并以乱序序列作为阴性对照（NC）.细胞转染24 h后进行诱导分化,连续诱导8 d,检测各处理细胞的聚脂情况及甘油三酯含量变化,荧光定量PCR检测脂肪细胞分化相关基因的表达变化.结果显示,猪皮下脂肪前体细胞分化过程中脂滴逐渐变大增多,miR-130a、TNF α和PPARγ的表达模式具有一定的相似性.转染结果显示,相对于对照组,miR 130a mimics转染组细胞脂滴减少变小,甘油三酯含量降低（P<0.05）,脂肪细胞分化相关基因LPL、PPARγ、adiponectin、FASN和葡萄糖转运相关基因GLUT1,GLUT4以及JNK通路上的PDE3B的表达均比对照组显著下调（P<0.01）;而miR-130a inhibitor转染组细胞则脂滴增多,甘油三酯含量提高（P<0.05）,但大部分分化相关基因的表达与对照组无显著差异,提示miR-130a可能不只通过单一的靶基因影响脂肪细胞分化.其结果为后续深入研究miR-130a调节猪脂肪细胞分化的通路及机制奠定基础.