红藻条斑紫菜凝集素的纯化及其色氨酸化学修饰对其活性的抑制作用

为了探索条斑紫菜凝集素(Porphyra yezoensis Ueda lectin, PYL)的作用机理,对其进行了分离和纯化．条斑紫菜经磷酸盐缓冲液浸泡、20%～75%硫酸铵分级、DEAE 纤维素52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析,得到PYL纯品. Sephadex G-200分子筛层析测得其分子量为63.2 kD,在非还原SDS-PAGE上显示1条蛋白染色带,分子量为63.1 kD,还原SDS-PAGE显示1条蛋白染色带,亚基分子量为15.8 kD．PYL在对兔、大鼠、鸡、羊、狗血细胞的凝集作用中,对大鼠红细胞的凝集活性最高.PYL在pH 6.50～10.53范围内均有活性,在pH 8.40～8.91活性最高．经42 ℃热处理10 min后,仍然对大鼠红细胞血凝活性保留12.5%,其活性最大温度范围为4 ℃～20 ℃, 48 ℃加热10 min后,其活性完全丧失．EDTA对PYL的凝集活性有抑制作用,最小抑制浓度为156 mmol/L,而 Ca2+和Mg2+未发生凝集抑制现象．PYL凝集大鼠红细胞的作用不被D 果糖、葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、菊粉、γ球蛋白、牛甲状腺球蛋白等所抑制,但可被蔗糖和麦芽糖抑制,最小抑制浓度蔗糖为20 mmol/L,麦芽糖为40 mmol/L．用N 溴代丁二酰亚胺(NBS) 对PYL分子中的Trp残基进行化学修饰,有2.1个Trp残基被修饰,修饰后PYL活性丧失, 表明Trp残基是PYL凝集活性所必需的基团．     

狗脊蕨凝集素的分离纯化与部分性质

狗脊蕨叶组织经磷酸缓冲液抽提,硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose(fast flow)离子交换层析和Sephadex G-100分子筛层析,获得具有凝集活性的狗脊蕨凝集素.用PAGE和SDS-PAGE检测均显示1条蛋白带,提示狗脊蕨凝集素分子只有一个亚基.Sephadex G-100层析和SDS-PAGE测得其相对分子质量在20 kD左右.该凝集素对红细胞有种属专一性,其凝集活性可被木糖、卵粘蛋白所抑制.狗脊蕨凝集素对热相当稳定,以100℃温度加热10 min仍保存部分凝集活性.凝集活性不依赖于金属离子Mg2 、Ca2 、Mn2 .它的中性糖含量为3.1%,Phe含量较高,His含量较低,不含Tyr和Pro.     

孔石莼(Ulya pertusa)凝集素的分离纯化及性质的研究

为抑制肿瘤细胞增殖和防治有关病害提供基础理论依据,将孔石莼(Ulva pertusa)经磷酸盐缓冲液抽提,20%～75%硫酸铵分级沉淀,牛甲状腺球蛋白-Sepharose 4B亲和层析,可以从绿藻孔石莼中纯化出孔石莼凝集素(UPL),在PAGE上显示单一蛋白染色带,在等电聚焦电泳上显示单一蛋白染色带,其pI为8.40.纯化后的UPL的最大紫外吸收峰在285 nm,用Sephadex G-200分子筛层析测得其分子量为11 047.该凝集素可以凝集人的A、B、AB、O型红细胞,且凝集活性相同,在对人(A、B、AB、O)兔、鲤、鲫的红细胞的凝集作用中,兔的凝集作用最强.该凝集素凝集兔红细胞的作用不被D-半乳糖、D-果糖、葡萄糖、蔗糖、甘露聚糖、γ球蛋白、卵清蛋白所抑制,仅被牛甲状腺球蛋白抑制,最小抑制浓度为6.20 g/L.该凝集素在pH4.0～10.14范围内均有活性,但在pH6.50～9.51范围内活性较高,该凝集活性在85℃加热1 h,活力仍未改变,说明具有很强的耐热性.     

孔石莼(Ulva pertusa)凝集素的分离纯化及性质的研究

为抑制肿瘤细胞增殖和防治有关病害提供基础理论依据 ,将孔石莼 (Ulva pertusa)经磷酸盐缓冲液抽提 ,2 0 %～ 75%硫酸铵分级沉淀 ,牛甲状腺球蛋白 - Sepharose4B亲和层析 ,可以从绿藻孔石莼中纯化出孔石莼凝集素 (UPL) ,在 PAGE上显示单一蛋白染色带 ,在等电聚焦电泳上显示单一蛋白染色带 ,其 p I为 8.40 .纯化后的 UPL的最大紫外吸收峰在 2 85nm,用 Sephadex G- 2 0 0分子筛层析测得其分子量为 1 1 0 4 7.该凝集素可以凝集人的 A、B、AB、O型红细胞 ,且凝集活性相同 ,在对人 (A、B、AB、O)兔、鲤、鲫的红细胞的凝集作用中 ,兔的凝集作用最强 .该凝集素凝集兔红细胞的作用不被 D-半乳糖、D-果糖、葡萄糖、蔗糖、甘露聚糖、γ球蛋白、卵清蛋白所抑制 ,仅被牛甲状腺球蛋白抑制 ,最小抑制浓度为 6.2 0 g/L.该凝集素在 p H4.0～ 1 0 .1 4范围内均有活性 ,但在p H6.50～ 9.51范围内活性较高 ,该凝集活性在 85℃加热 1 h,活力仍未改变 ,说明具有很强的耐热性 .     

岩豆(Millettia dielsiana Harms ex Diels)凝集素的分离纯化和性质研究

用猪甲状腺球蛋白-Sepharose 4B作亲和吸附剂,再经Sephadex G-100凝胶过滤,可以从岩豆种子中纯化出岩豆凝集素(MDL)。该凝集素可以凝集人类A、B、O型血细胞和兔红细胞,纯化的MDL凝集兔红细胞的能力可被D-松三糖、邻硝基-苯酚-D-半乳糖和N-乙酰半乳糖胺抑制,甘露糖也有弱的抑制作用。纯化的MDL在PAGE和SDS-PAGE上均显现单一蛋白质染色带,经Schiff’s试剂染色证明为糖蛋白;以酚-硫酸法测得其中性糖含量为6.0％;SDS-PAGE测得亚基分子量为32 000;Sephadex G-100分子筛柱测得其分子量为63 800;等电聚焦电泳显示其等电点为5.1;氨基酸组成分析表明其中Asp、Glu、Phe含量较高,但不含有Pro、Tyr。MDL也是一个强促有丝分裂原,对人外周血淋巴细胞转化率可达81.2％,细胞分裂比率达14.8％。     

黑色菜豆(Phaseolus sp.)凝集素的纯化和性质

黑色菜豆(phaseolussp.)种子中含有对人A型血专一凝集的凝集素。用猪胃粘蛋白-Sepharose 4B作亲和吸附剂和Sephadex G-200凝胶过滤,可以纯化这种凝集素。纯化的凝集素在pH8.9,Tris-EDTANa_2-borate缓冲液的PAGE中,呈现单一蛋白带;酚-硫酸法测得总糖含量为3.22％。在SDS-PAGE中发现其分子由两种亚基所组成,亚基分子量分别为38,000和35,000。当凝集素浓度分别为0.98μg/ml和1.95μg/ml时能强烈地凝集人A型和AB型血细胞。在凝集素浓度高达500μg/ml时,B型血细胞能发生弱凝集反应,但对O型血和兔红细胞则完全不发生凝集反应。其凝集活性可被GalNAC、L-Fuc、猪甲状腺球蛋白和卵粘蛋白所抑制。该凝集素对人外周血中淋巴细胞的转化率达80％,细胞分裂比率高达37.1％;氨基组成分析表明,凝集素分子中Asp和Glu含量较高,而cys和Met含量很低。     

鸡凝集素的分离纯化与性质研究

鸡菌丝体浸取液依次经硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析和Sephadex G-100分子筛层析3个主要步骤纯化得到一种凝集素(Termitomyces albu-minosus lectin,简称TAL)。纯化的TAL在聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示一条蛋白质着色带。TAL的分子量为89.4kD,亚基分子量为38kD和51kD,提示TAL分子由两个不同亚基组成。TAL具有供血动物种属专一性,使Wistar大鼠红细胞凝集所需TAL最低的浓度为0.49μg/ml。糖抑制试验表明,鸡卵粘蛋白明显抑制TAL的凝血活性。TAL对热不稳定,60℃保温15min活力完全丧失。钙、镁或锰离子对TAL无激活作用。TAL不含不性糖,Glu和Asp含量较高,His和Met含量较低。     

桑黄发酵液中凝集素SHL24的分离与生物活性研究

【背景】桑黄是一种具有很高药用价值及广泛应用前景的药用真菌,其主要有效成分为多糖。凝集素则是桑黄所含的另一类生物活性物质,具有免疫调节、抗肿瘤及抗菌等作用。【目的】从药用真菌桑黄发酵液中分离纯化凝集素SHL24,并对其生物活性进行初步探究。【方法】通过冷冻干燥、Sephadex G-50、DEAE Sephadex A-25、MPLC-MonoQ和LPLC-Sephadex G-75等方法,从药用真菌桑黄的发酵液中进行分离纯化;利用LPLC-Sephadex G-75和SDS-PAGE凝胶电泳鉴定其分子质量;检测不同pH、金属离子、糖、发酵时间、血红细胞、温度对其凝血活性的影响。【结果】从药用真菌桑黄发酵液中分离到单一蛋白条带,SDS-PAGE凝胶电泳检测其分子质量约为24 kD,与分子筛层析法分析的分子质量一致,表明该凝集素为单亚基蛋白。SHL24可以凝集供试的小鼠血红细胞和4种血型人血的血红细胞,但对不同来源的血红细胞凝集程度不同。糖抑制试验表明,SHL24不被D-甘露糖、D-麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、树胶醛糖、D-乳糖以及L-鼠李糖所抑制。热稳定性试验和金属离子对SHL24凝血活性影响试验表明SHL24具有较好的热稳定性且其凝血活性不受Ca~(2+)、Mg~(2+)和Zn~(2+)等二价阳离子的影响。【结论】SHL24具有的稳定理化性质和生物活性,有作为蛋白质药物的潜质。     

正红菇菌丝体凝集素的分离纯化及生化特性

正红菇菌丝体经磷酸缓冲液浸提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose FF离子交换层析和Sephadex G-100分子筛层析纯化得到红菇凝集素（Russula vinosa Lectin,RVL）。经SDS-PAGE检测为单一蛋白带,其亚基相对分子质量为55kDa,Sephadex G-100凝胶过滤测得相对分子质量为55.25kDa,提示RVL分子只有一个亚基。RVL中性糖含量为3.87%,经酸水解测定含15种氨基酸。温度在20–60℃、pH在5–9的范围内,凝集活性保持相对的稳定。RVL的凝血活性受Mn2+、Zn2+、Ca2+的影响。糖抑制实验表明,在供试的11种糖中,D-甘露糖强烈抑制RVL的凝血活性。抑菌实验显示,RVL对供试的细菌没有抑制作用,对稻瘟病菌、绿色木霉、红色链包霉、黑曲霉菌丝生长有显著的抑制作用。     

扇叶铁线蕨凝集素的糖蛋白特性

扇叶铁线蕨叶片组织经磷酸盐缓冲液浸提,硫酸铵沉淀,再经过DEAE-Sepharose—FF和Sephadex G-100层析纯化,得到扇叶铁线蕨凝集素(AFL)。其凝集活性依赖于Ca^2 和Mn^2 ,经测定AFL,是一种分子质量为22000—22500的糖蛋白,分子中含有4．0％的中性糖,具有很高的耐热性,浓度为37．5μg ml^-1的AFL凝血活性可被甘露糖抑制,卵粘蛋白可完全抑制AFL的凝血活性。浓度为2．34μg ml^-1时引起兔血细胞凝集,并能凝集人的A、B或O型血细胞,对鳖的血细胞没有凝集作用。AFL能凝集藻类细胞、酿酒酵母细胞及经过热处理的枯草芽孢杆菌。在AFL的氨基酸组成中不含Tyr。研究结果表明,该凝集素具有糖蛋白的特性。     

三齿草藤(Vicia bungei Ohwi)凝集素的亲和层析纯化及其部分性质的研究

用Sephadex G-100或猪甲状腺球蛋白-对氨基苯砜乙基-交联琼脂作亲和吸附剂,均可从三齿草藤(Vicia Bungei Ohwi)的种子中分离纯化出三齿草藤凝集素。该凝集素经连续或不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳均显示出单一蛋白带;糖蛋白染色法证实为糖蛋白;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量为24,600,凝集素浓度为1.95微克/毫升时就能凝集兔红细胞;但对人ABO型血细胞不发生凝集作用;其对兔红细胞的凝集作用可被D-Man、D-GlcNA和D-GIC所抑制;它也是一种促有丝分裂原。     

家蝇幼虫血淋巴中凝集素的研究

家蝇幼虫血淋巴中凝集素不但能凝集兔、羊、鸡、豚鼠、小鼠和大鼠的红细胞,而且能凝集任何血型人的红细胞,其凝集活性能被D-半乳糖和乳糖所抑制。比较了不同诱导源诱导后血凝活性的动力学变化,发现体壁损伤后凝集素应答较快,活性高、消退快;~(60)Coγ射线诱导后凝集素应答较慢、活性低、消退较慢;超声波和紫外线几乎无诱导作用。还发现化蛹后24小时的血淋巴其凝集活性也较正常的高。     

牛舌菌凝集素的分离、性质及细胞凝集活性

牛舌菌子实体经生理盐水抽提、硫酸铵沉淀、DEAE-Cellulose和Sephadex G-100柱层析纯化得到牛舌菌凝集素(Fistulina hepatica Lectin,FHL)。FHL经PAGE显示单一条带,SDSPAGE测得其亚基相对分子质量为63．6KD,Sephadex G-100凝胶过滤测得相对分子质量为63KD,FHL中性糖含量为9．7％,IEF-PAGE测得其等电点为5．36。该凝集素对人的A、B、AB和O型血细胞具有凝集作用,对兔红细胞的凝集作用可被乳糖和N-乙酰半乳糖胺所抑制。氨基酸组成分析表明,FHL含有16种氨基酸,其中天冬氨酸和谷氨酸含量较高。FHL对热、酸具有一定的稳定性,经60℃处理10min,仍有较高的活性,在pH3．0～6．0范围内较稳定,但在碱性pH环境中(pH7．0～10．8),FHL的凝集活性下降明显。β-消去反应测得其糖和蛋白质的连接键为O-型糖肽键。抗肿瘤活性测定表明,FHL对HeLa细胞具有明显抑制作用。     

厚果鸡血藤凝集素的纯化及性质

从厚果鸡血藤（ＭｉｌｅｔｉａｐａｃｈｙｃａｒｐａＢｅｎｔｈ．）的种子中分离纯化出一种具强凝集活性和强促有丝分裂原的凝集素。种子经磨粉、浸取、硫酸铵分级、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００分子筛层析,即可获得在ＰＡＧＥ和ＳＤＳＰＡＧＥ上均呈现单一蛋白染色带的凝集素纯品,分子筛层析测得分子量为４０７００,ＳＤＳＰＡＧＥ测得亚基分子量为１９８００;含有１７８％的中性糖。氨基酸组成分析表明,该凝集素富含Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ和Ｌｅｕ,同时含有４个Ｔｒｐ,当凝集素浓度为０．４８μｇ／ｍＬ时,即可凝集兔红细胞;对人Ａ、Ｂ和Ｏ型血细胞都能发生凝集,故无血型专一性;其凝集兔红细胞的凝集活性,不能被常见糖类抑制,但可被甲状腺球蛋白、胃粘蛋白和卵粘蛋白所抑制;其凝集活性强烈地依赖于Ｃａ２＋的存在,但Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋对其凝集活性全无促进作用;该凝集素是一种强促有丝分裂原,对人外围血中淋巴细胞的转化率高达８４３％,细胞分裂比率可达７８％。     

甘薯凝集素的提取及性质研究

抗蔓割病甘薯的叶片组织浸取液,经硫酸铵分级沉淀,甲壳素柱层析及葡聚糖凝胶过滤得到一种在PAGE或SDS－PAGE上均呈现单一蛋白带的甘薯凝集素。该凝集素没有血型专一性及被测动物红细胞专一性,其凝集活性可被N－乙酰葡萄糖胺或岩藻糖所抑制。甘薯凝集素在75℃加热10min,即丧失全部凝集活性,其凝集活性依赖于Ca^2 和Mg^2 ,Mn^2 则无作用。经Sephadex G-100和SDS－PAGE测定,凝集素相对分子质量为63000,中性糖含量为6.21%,该凝集素对蔓割病菌有抑制作用,是一种酸性糖蛋白。     

泥蚶(Tegillarca granosa Linnaeus)血淋巴液凝集素的分离纯化及其性质研究

泥蚶是一种重要的海产经济贝类,其血淋巴液经硫酸铵二步分级沉淀后,再经Sephadex G- 100凝胶过滤和Sepharose 4B亲和层析纯化制得泥蚶血淋巴液凝集素。经测定,该凝集素分子量约为123Kda,为两个亚基的蛋白质,其相对分子量分别为15 KDa和16 KDa,分子中含5．02％的糖。在氨基酸组成中,天门冬氨酸(Asp)含量最高,其次是谷氨酸(Glu)和组氨酸(His),不含蛋氨酸(Met)。泥蚶血淋巴液凝集素对多种天然或经酶修饰的人或动物红细胞具有不同的凝集作用,其中对兔红细胞的凝集活性最大。半乳糖和乳糖对其凝集活性具有抑制作用。凝集活性依赖于Ca2 ,在pH7．0较稳定,热稳定性不高,在30℃-70℃时凝集效价由原来的25下降为21,当温度超过80℃以后,凝血活性完全丧失。     

四种蕈菌凝集素的筛选及活性检测

以长刺猴、白平菇、毛尖蘑、滑菇四种蕈菌为材料,经硫酸铵沉淀、透析,得到蛋白质提取液,用不同类型的红细胞检测凝集活性(人的A型、B型、AB型、O型血,兔血、鸡血、蛤蟆血)。结果表明,长刺猴、白平菇、滑菇3种蕈菌的提取物中均含有凝集素,桦树蘑对兔红细胞凝集性最强。凝集活性可分别被一种或多种类型糖所抑制。同时它们均表现出较好的热稳定性及pH耐受性,金属离子对凝集素的影响也相当大。     

一株产凝集素的三叶半夏内生真菌的研究

研究三叶半夏内生真菌及其凝集素,旨在为半夏内生真菌及其凝集素的开发利用提供依据。对三叶半夏块茎内生真菌分离、纯化,液体发酵培养代谢产物,无水乙醇提取总蛋白,兔血红细胞检测其凝集活性,筛选出菌株gs1,其总蛋白对兔血红细胞凝集活性显著。使用甘露聚糖-Sepharose 4B亲和层析柱纯化菌株gs1总蛋白,得到凝集素。Brandford法定量检测分析表明,1000 ml gs1发酵培养液中含有9.58 mg 凝集素。SDS-PAGE 电泳分析显示该凝集素为单一条带,分子量约为12 kDa。凝集活性实验表明,该凝集素对兔、大鼠和小鼠的血红细胞具有凝集作用,对兔血红细胞效果最显著;而对人（A＼B＼O＼AB型）和鸡的血红细胞无凝集作用。糖结合活性实验表明,甘露糖对该凝集素的凝集活性具有抑制作用。通过初步分类鉴定,菌株gs1为半知菌亚门,丝孢纲,丛梗孢目,丛梗孢科,曲霉属。     

香螺血清、肌肉和唾液腺凝集素凝集性能的初步研究

研究香螺(Naptunea cumingi crosse)肌肉、血清和唾液腺凝集素对7 种脊椎动物红细胞、人的4 种红细胞、4 种单细胞藻类和11 种微生物细胞的凝集性能,同时进行pH敏感性、热稳定性、糖抑制性、EDTA、金属离子以及盐浓度影响试验.结果表明,3 种凝集素对各种细胞的凝集效应存在差异,以家兔红细胞的凝集效果最佳.肌肉和血清凝集素在pH<7.0时均失活,唾液腺凝集素的热稳定性最强,温度为90 ℃仍具有活性.此外,不同的糖溶液对3 种凝集素凝集效果的影响不同,在EDTA浓度为2.00～0.25 mmol/L范围内,3 种凝集素的凝集效价均受到不同程度的抑制.在金属离子影响试验中发现,Zn2+能明显提高肌肉和血清凝集素的凝集活力,而对唾液腺凝集素有抑制的作用.当盐浓度为12～18 g/L时,可增加香螺肌肉凝集素的凝集效价,而当浓度为24～60 g/L时却会抑制肌肉凝集素的凝集活性.     

舍蝇(Musca domestica vicina)凝集素的分离、纯化和部分性质研究

舍蝇蛹体液经抽提后上Sepharose 4B亲和层析柱纯化制得舍蝇凝集素。制剂经聚丙烯酰胺凝胶电泳和在SDS-PAGE上均呈单一蛋白带,表观分子量为33400。它能凝集人B型红细胞,亦能凝集小白鼠及兔血红细胞。其专一结合的糖为半乳糖与D-及L-岩藻糖。