Construction of a genetic linkage map in Fenneropenaeus chinensis using SNP markers

Genetic linkage maps of Fenneropenaeus chinensis were constructed using a “double pseudo-testcross” strategy with 200 single nucleotide polymorphisms (SNPs) markers. This study represents the first SNP genetic linkage map for F. chinensis. The parents and F ₁ progeny of 100 individuals were used as mapping populations. 21 genetic linkage groups in the male and female maps were identified. The male linkage map was composed of 115 loci and spanned 879.7 cM, with an average intermarker spacing of 9.4 cM, while the female map was composed of 119 loci and spanned 876.2 cM, with an average intermarker spacing of 8.9 cM. The estimated coverage of the linkage maps was 51.94% for the male and 53.77% for the female, based on two estimates of genome length. The integrated map contains 180 markers distributed in 16 linkage groups, and spans 899.3 cM with an average marker interval of 5.2 cM. This SNP genetic map lays the foundation for future shrimp genomics and genetic breeding studies, especially the discovery of gene or regions for economically important traits in Chinese shrimp.     

中国对虾抗WSSV及其它经济性状的QTL定位初步研究

以中国对虾抗WSSV选育群体第四代雌虾和野生中国对虾雄虾为亲本,采用人工精荚移植方式产生F1代家系,家系内个体姊妹交获得R家系材料,42尾R家系个体采用口饲法进行WSSV（White Spot Syndrome Virus）攻毒实验,获得个体抗WSSV及其它相关数据。构建了中国对虾的AFLP（Amphfied Fragment Length Polymorphism）分子标记遗传连锁图谱。利用MAPMAKER／QTL1．1软件进行了中国对虾体长、全长、体重及抗WSSV性状的QTL（Quantitative TraitsLoci）定位分析,首次实现了中国对虾重要经济性状的QTL定位。在LOD值大于2．0的条件下,共检测到和体长相关的QTL位点1个,与全长相关的QTL位点2个,与体重相关的QTL位点2个,与抗WSSV性状相关的位点2个,分别位于3个连锁群上,位点变异解释率从26．6％-66．9％不等。在其中的1个连锁群上检测到了体重、全长和抗WSSV性状相关的三个QTL位点,1个连锁群上检测到了体重和抗WSSV性状相关的两个QTL位点,1个连锁群上检测到了全长和体长相关的两个QTL位点。表明在中国对虾在此生长阶段,抗WSSV性状和个体大小存在一定程度的正相关关系[动物学报54（6）：1075-1081,2008]。     

食管癌细胞NGAL基因－152 ～ －60区段存在TPA反应元件

以往研究发现,在TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL) 基因过表达,但过表达机制不明. 最近研究提示,食管癌细胞NGAL启动子及其邻近区域可能存在着TPA反应元件. 为了对NGAL的这一TPA反应元件进行更准确定位,采用PCR法结合嵌套缺失实验从食管癌细胞中克隆了NGAL 5′ 侧翼区－152～+84、－140～+84、－78～+84、－59～+84、－50～+84、－41～+84、－37～+84、－29～+84和－10～+84等片段,并定向插入pGLB、pGLP或pGLE等萤火虫荧光素酶报告基因表达载体中,构建了pGLB-152、pGLP-152、pGLE-152、pGLB-140、pGLB-78、pGLB-59、pGLB-50、pGLB-41、pGLB-37、pGLB-29和pGLB-10等系列报告基因表达载体. 将上述报告基因表达载体分别同pRL-TK共转染食管癌细胞EC109,并用TPA刺激,检测TPA刺激转染EC109的相对荧光素酶活力,综合判定NGAL －152～+84区不同长度片段的TPA反应性,对NGAL启动子区的TPA反应元件给予进一步分段定位. 结果表明,NGAL启动子区的TPA反应元件位于－152～－60区段,而且应答TPA刺激的反应能力很强. 生物信息学分析结果显示,NGAL启动子区所存在的TPA反应元件很可能是一种新结构类型. 研究说明,NGAL在DNA序列上有应答TPA刺激的结构基础,将有助于深入到分子水平揭示TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中NGAL过表达机制,也有助于进一步认识TPA信号细胞内传递途径网络在肿瘤发生发展中的作用.     

NGAL基因新型TPA反应元件结合蛋白的研究

以往研究发现,食管癌细胞的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)基因的过表达具有明显的12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(12-O-tetradecanoyl phorboi-13-acetate,TPA)诱导性,在启动子-152～-60 区段存在着一种新型的TPA反应元件(TPA response element,TRE),但是该元件的结合蛋白尚未被鉴定出来.采用寡核苷酸DNA亲和层析法(oligonucleotide trapping)从食管癌细胞中分离纯化了NGAL基因TRE结合蛋白;经SDS-PAGE进一步分离,银染显示目标蛋白带.人工切取各目标蛋白带进行MALDI-TOF-MS分析,通过Mascot软件搜索NCBI数据库,根据蛋白质的功能、细胞定位和分子质量大小等指标确定8个核蛋白因子:C19、KIAA1949、TDRD1、RXRβ、FAM54A、KLF15、KLF10和YY-1.最后,利用RT-PCR验证了这些核蛋白因子表达的TPA反应性,结果表明C19、KIAA1949、TDRD1、RXR β和KLF15等编码基因的转录表现出了明显的TPA反应性,提示可能是食管癌细胞中应答TPA刺激,参与NGAL基因过表达的转录激活因子.     

反义封闭NGAL基因表达对SHEEC食管癌细胞微丝骨架的影响

为了研究反义封闭NGAL基因表达对SHEEC食管癌细胞微丝骨架以及肿瘤细胞生物学行为的影响,以不同长度NGAL基因片段反义表达载体和硫代修饰反义寡核苷酸单链片段转染SHEEC食管癌细胞,通过G418筛选,建立一系列旨在封闭SHEEC食管癌细胞NGAL基因表达的亚细胞克隆.在细胞内F-肌动蛋白(F-actin)及DNA荧光双标记基础上,通过流式细胞术、激光共聚焦显微镜扫描术等技术手段检测封闭反义NGAL基因表达后, SHEEC食管癌细胞中F-actin和DNA含量、F-actin形态结构以及肿瘤细胞生物学行为的变化特征.结果显示,反义封闭NGAL基因表达后,SHEEC食管癌细胞F-actin的含量明显降低,与永生化食管上皮细胞SHEE相近,但细胞分裂增殖指数未见明显变化.表明反义封闭NGAL基因表达对SHEEC食管癌细胞的微丝骨架有明显影响,而对SHEEC食管癌细胞的分裂增殖影响不明显.激光共聚焦显微镜扫描观测显示,反义封闭NGAL基因表达可使SHEEC食管癌细胞F-actin分布均匀,F-actin小体减少,细胞间连接重新建立,结构较紧密,主要形态结构特征与SHEE细胞趋于一致.提示反义封闭NGAL基因表达可对SHEEC食管癌细胞的微丝骨架F-actin产生明显影响,推测癌细胞的微丝骨架F-actin可能是NGAL基因在SHEEC食管癌细胞中发挥功能的一种作用环节.     

中国明对虾AFLP分子标记遗传连锁图谱的构建

以中国明对虾抗WSSV(白斑综合症病毒,WhiteSpotSyndromeVirus)选育群体第四代为母本,野生中国明对虾为父本,采用单对杂交方式产生F1代,F1代个体姊妹交产生F2代共42个个体为做图群体。62对AFLP选择性引物组合共产生529个分离位点,符合1∶1孟德尔分离类型位点共253个,3∶1孟德尔分离类型位点共276个。利用拟测交理论分别构建中国明对虾雌虾、雄虾的遗传连锁图谱,利用F2自交模型构建共同的AFLP分子标记连锁图谱。三张连锁图上分别有31、25和44个连锁群,图谱分辨率为分别为2.4cM、2.4cM和2.1cM。标记间隔距离分别为12.20cM、11.45cM和11.12cM图谱覆盖率分别达到50.21%、51.93%和48.08%。能够基本满足进行QTL(数量性状位点,QuantitativeTraitLocus)定位的需要。将该图谱和其他对虾类遗传连锁图谱进行了比较分析,探讨了利用相关分子标记将已有图谱进行整合的可能。     

不同补料控制方式发酵生产头孢菌素C的性能比较

在7 L发酵罐下,对利用顶头孢霉菌(Cephalosporins acremonium)发酵生产头孢菌素C(CPC)过程的最优底物流加工艺进行了研究。提出了一种新式硫铵豆油耦联型的硫铵流加策略。该控制策略可将发酵液中的氨态氮浓度控制在3 6 g/L之间,同时满足了发酵前期细胞生长与CPC合成对氮源和硫源的需求,促进了顶头孢霉菌菌丝分化,为发酵后期的CPC高效生产奠定了前期基础。比较了CPC合成期内间歇、匀速和DO-Stat自动流加3种不同豆油流加方式的发酵性能。研究发现,耦联使用硫铵/后程通富氧空气DO-Stat法进行硫铵和豆油的同时补料和CPC发酵,可将碳源浓度与溶解氧浓度DO同时控制于适中水平,使CPC合成以高浓度和低副产物积累的方式进行,最终CPC浓度和得率分别达到35.77 g/L和13.3%。主代谢副产物脱乙酰氧头孢菌素C(DAOC)的积累量和DAOC/CPC分别仅有0.178 g/L和0.5%。     

人食管癌cDNA酵母杂交文库的构建与鉴定及其应用

以往在研究由促癌物12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酯（12-o-tetradecanoylphorbol-13 -acetate,TPA）诱导的人永生化食管上皮细胞恶性变中基因的差异表达情况时,曾获得中性粒细胞明胶酶相关lipocalin（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）等新的食管癌癌变相关基因.为深入研究这些癌变相关基因在食管癌中以蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA相互作用为基础的功能网络调控关系,建立了一个食管癌cDNA酵母杂交文库.采用Trizol试剂从一种新的人食管癌细胞（SHEEC,由人永生化食管上皮细胞转化而来）中提取细胞总RNA,采用Oligotex mRNA Kit从细胞总RNA中制备PolyA⁺ mRNA,采用SuperScript^TM Choice System For cDNA Synthesis Kit合成cDNA,以PolyA⁺ mRNA为探针,化学发光法监测cDNA合成的质量,以pGADT₇为载体构建了SHEEC细胞的cDNA酵母杂交文库.文库的滴度为1.19×10⁹ cfu/ml,重组片段大小主要集中在0.5～6.0 kb,重组率为50％.在此基础上,应用酵母单杂交技术手段对该文库中的NF-κB元件结合因子进行了筛选,在SD/-his/-leu/［＋15 mmol/L 3-AT］缺陷培养基平板上共获得了约360个单克隆.按照平板上酵母单克隆直径的大小,选择直径大于2 mm者91个,提取质粒进行酶切鉴定和一对一酵母单杂交验证实验,结果获得了30个阳性重组子,并随机取其中的9个阳性重组子进行测序和GenBank/BLAST同源分析,发现某些基因编码的蛋白质产物在关键氨基酸残基位点上与p65和p50的NF-κB元件结合域公共序列具有高度一致性.这些实验结果表明,所构建的人食管癌cDNA酵母杂交文库是成功的.     

五条河流青海湖裸鲤的同工酶变异

为全面了解青海湖裸鲤遗传多样性现状,采用水平淀粉凝胶电泳技术分析了青海湖裸鲤[样品采自青海湖的五条支流,分别为泉吉河(QJ)、沙柳河(SL)、哈尔盖河(HEG)、布哈河(BH)以及甘子河(GZ)]的13种同工酶,共记录26个位点,统计了基因频率,计算了其遗传多样性。结果表明:26个基因位点中多态位点6个,分别为Pgm、Hk、Cat、Gdh、Es-t1、S-Mdh,多态位点比例(P0.99)为23.08%,表明青海湖裸鲤的五个群体皆具有较高的遗传多样性水平;分别计算了五个群体的平均杂合度(H)为0.1161(HEG)、0.1178(GZ)、0.1304(SL)、0.1305(BH)、0.1287(QJ),多态位点比例(Ae)分别为1.3112(BH)、1.3069(SL)、1.2542(GZ)、1.2492(HEG)、1.2453(QJ);除泉吉河群体外,其它四个群体的遗传偏离指数均为负数,表明多数群体处于一定程度的杂合子缺失状态;计算了五个群体间的遗传距离以及遗传相似度,结果显示群体间遗传距离与遗传相似度与各个河流的地理位置具有很强的相关性;根据五个群体的遗传距离进行了聚类分析,通过构建系统树图将其基本分为两大种群,甘子河与哈尔盖河两群体为一类群,另外三个群体分为一个类群;计算群体间的基因流(Nm)为7.2013,说明河道之间具有较为广泛的基因交流,并计算了两两群体间的基因流,其中布哈河群体与其它群体间的基因交流都较为广泛。