蛇足石杉内生真菌Shiraia sp. Slf14中赖氨酸脱羧酶基因的克隆、表达及功能

【目的】阿尔茨海默症治疗药物石杉碱甲(Huperzine A,Hup A)的生物合成途径起始于赖氨酸脱羧酶(Lysine decarboxylase,LDC)。本研究克隆及表达了来源于产Hup A的植物内生真菌的LDC基因,并研究了其功能。【方法】采用RT-PCR扩增法,从一株产Hup A的蛇足石杉内生真菌Shiraia sp.Slf14获得LDC基因,构建表达质粒p ET-22b-LDC与p ET-32a-LDC,转化感受态细胞E.coli BL21,加入IPTG至终浓度为1×10~(–3) mol/L,于24°C、200 r/min培养8 h,诱导表达LDC蛋白质;通过Ni~(2+)金属亲和层析纯化重组LDC并建立酶促反应体系,利用TLC检测了LDC催化活性。利用生物信息学软件分析了LDC的理化性质及蛋白质的空间结构。【结果】成功克隆并异源表达出重组蛋白LDC与Trx-LDC,经SDS-PAGE电泳鉴定分子量分别为24.4 k Da和42.7 k Da,与预计大小相符。TLC结果表明LDC与Trx-LDC均具有赖氨酸脱羧酶活性。【结论】本研究从产Hup A的蛇足石杉内生真菌Shiraia sp.Slf14中成功克隆到LDC基因并进行了异源表达,检测到了其催化活性,为丰富LDC分子信息及阐明内生真菌中Hup A生物合成机制提供参考数据。     

炭样小单孢菌中抗生素生物合成相关蛋白的筛选

目的：筛选一株具有广谱抗菌活性的炭样小单孢菌JXNU-1中核苷类抗生素生物合成相关蛋白。方法：通过iTRAQ定量蛋白质组学技术对JXNU-1菌体生长期（36h）和产物合成期（108h）的差异蛋白进行鉴定和功能分析。结果：基于iTRAQ定量蛋白质组学技术共鉴定出炭样小单孢菌总蛋白质2390个,差异表达蛋白172个,在产物合成期（108h）表达上调76个、表达下调96个。通过蛋白GO和COG注释等功能分析,筛选出12个与抗生素合成密切相关蛋白和5个生物合成基因簇。结论：利用iTRAQ技术筛选出炭样小单孢菌JXNU-1的抗生素合成相关蛋白,为阐明该抗生素的生物合成机制奠定实验依据。     

蛇足石杉内生真菌Shiraia sp. Slf14全基因组序列分析

内生真菌Shiraia sp. Slf14是从植物蛇足石杉(Huperzia serrata)中分离出来的一株能产生石杉碱甲和竹红菌素A的菌株。为了解菌株Shiraia sp. Slf14的基因特征,对该菌株进行全基因组测序。基于二代测序技术对蛇足石杉内生真菌Shi-raia sp. Slf14的全基因组进行测序分析,通过生物信息学相关软件进行质量控制及组装、功能注释、比较基因组学分析及系统发育分析和次生代谢产物分析。内生真菌Shiraia sp. Slf14的基因组大小为32 067 383 bp, N50的值为525 954 bp, G+C含量为47.96%;预测得到基因组中共有11 242个编码序列(coding sequences, CDS)、 106个tRNA和27个rRNA;在GO、 KEGG、 KOG和CAZY中分别注释到3 822个、 3 223个、 8 837个和563个基因;系统发育结果表明内生真菌Shiraia sp. Slf14属于竹黄菌属(Shiraia)。预测结果表明,内生真菌Shiraia sp. Slf14中存在50个次生代谢产物合成基因簇,具有合成多种...     

雄烯二酮高产菌新金分枝杆菌MN4的全基因组测序及序列分析北大核心CSCD

【目的】新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)MN4是1株经诱变育种获得的高产雄烯二酮,并且能够耐受高浓度底物植物甾醇的突变菌株。为深入研究MN4菌株耐底物的机制及雄烯二酮的生物合成途径,有必要解析MN4菌株的全基因组序列信息。【方法】本研究采用高通量测序技术对MN4进行全基因组测序,然后使用相关软件对测序数据进行基因组装、基因预测与功能注释、COG聚类分析以及次级代谢产物合成基因簇预测等。【结果】新金分枝杆菌MN4基因组装获得33个Contigs,整个基因组大小为5.39 Mb,GC含量为66.9%,编码4920个蛋白基因,序列提交至Gen Bank数据库,登录号为JXYZ00000000。【结论】本研究首次报道了1株高产雄烯二酮菌株MN4的全基因组序列,分析了基因组的基本特征,初步解析了该菌株降解植物甾醇生产雄烯二酮的关键基因,将为MN4的功能基因组学研究及相关次级代谢产物的生物合成途径与异源表达研究提供基础。     

东乡野生稻内生放线菌Streptomyces sp. PRh5的全基因组测序及序列分析

【目的】Streptomyces sp. PRh5是从东乡野生稻(Oryza rufipogon Griff.)中分离获得的一株对细菌和真菌都具有较强抗菌活性的内生放线菌。为深入研究PRh5菌株抗菌机制及挖掘次级代谢产物基因资源,有必要解析PRh5菌株的基因组序列信息。【方法】采用高通量测序技术对PRh5菌株进行全基因组测序,然后使用相关软件对测序数据进行基因组组装、基因预测与功能注释、直系同源簇(COG)聚类分析、共线性分析及次级代谢产物合成基因簇预测等。【结果】基因组组装获得290 contigs,整个基因组大小约11.1 Mb,GC含量为71.1%,序列已提交至GenBank数据库,登录号为JABQ00000000。同时,预测得到50个次级代谢产物合成基因簇。【结论】将为Streptomyces sp. PRh5的功能基因组学研究及相关次级代谢产物的生物合成途径与异源表达研究提供基础。     

丙酮破碎法提取重组大肠杆菌表达的转谷氨酰胺酶酶原

以茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的基因组DNA为模板,PCR扩增出转谷氨酰胺酶酶原基因(pro-transglutaminase,pro-TG)),PCR产物连接到pMDl8-T克隆载体后亚克隆到表达载体pET-22b(+),转化到表达宿主大肠杆菌BL2l(DE3).重组大肠杆菌经IPTG诱导后,转谷氨酰胺酶酶原(pro-TG)主要以可溶性蛋白表达.菌体离心后用丙酮高速搅拌破碎细胞,亲和层析成功地纯化到了转谷氨酰胺酶酶原.转谷氨酰胺酶酶原经胰蛋白酶切割激活后其酶活为502.8 U/g CDM(菌体干重).采用BSA交联试验证实成熟的转谷氨酰胺酶(TG)具有功能.采用丙酮破碎法提取重组大肠杆菌表达的转谷氨酰胺酶酶原对大规模工业化生产转谷氨酰胺酶进行了有益的探索.     

卡奇霉素产生菌棘孢小单胞菌ATCC 15837的全基因组测序及序列分析

棘孢小单胞菌(Micromonospora echinospora) ATCC 15837是一种高GC含量的革兰氏阳性稀有放线菌,能够合成烯二炔类抗肿瘤抗生素卡奇霉素(calicheamicin, CLM)。目前,还没有相关研究报道棘孢小单胞菌ATCC 15837的全基因组序列,这限制了其代谢产物合成途径和比较基因组学等研究。本研究首次通过高通量测序技术对棘孢小单胞菌ATCC 15837进行全基因组测序,使用相关生物信息学软件对数据进行组装和注释等分析。使用Velvet软件进行组装拼接得到77个Contigs,GC含量为72.36%,基因组大小约为7.69 Mb。序列已提交至美国国立生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库(登录号为NGNT00000000)。本研究首次报道了一株烯二炔类抗肿瘤抗生素卡奇霉素产生菌棘孢小单胞菌ATCC 15837的全基因组序列,分析了基因组基本特征,预测了该菌株的次级代谢产物生物合成基因簇,为后续的进一步代谢调控与合成生物学提供了理论基础。     

透明颤菌血红蛋白在枯草芽孢杆菌WB800中的表达及其对菌体生长的影响

通过基因工程的方法,将透明颤菌血红蛋白基因(vhb)置于大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pBEP43-DFE的强启动子P43下,构建重组质粒pBEP43-vhb,并通过化学感受态法转入枯草杆菌WB800中,转化子经过酶切和PCR验证。采用一氧化碳差异色谱法测定转入的血红蛋白基因具有表达活性。通过限氧试验表明,血红蛋白基因能在低氧环境下促进菌体的生长。