血红蛋白基因在枯草芽孢杆菌中的表达及其作用的研究

革兰氏阴性菌Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ的血红蛋白与氧结合力强,能降低该菌需氧量。将该血红蛋白的结构基因（Ｖｇｂ）连接到枯草杆菌质粒ｐＡＫ４的β－内酰胺酶基因（ｂｌａ）启动子下（框架正确）,构建了重组质粒ｐＡＶ,并将此质粒先转化至枯草杆菌ＤＢ１０４,继而又转化到枯草杆菌碱性蛋白酶工程菌Ｇ３３１和产木聚糖酶枯草杆菌Ｂ５３。经酶切和电泳分析显示转化的质粒ＤＮＡ含有大小与Ｖｇｂ相同的电泳带,又经非放射性同位     

用遗传工程的方法构建一个分泌型高表达的枯草杆菌碱性蛋白酶E(Subtilisin E)的枯草杆菌质粒-宿主系统

将克隆了枯草杆菌蛋白酶E基因aprE的枯草杆菌质粒pPZW101和一个组成型強启动子Psk连接构建成质粒pPZW102,转入碱性和中性蛋白酶缺失枯草杆菌DB104并进行表达。此质粒-宿主系统具有Subtilisin E高表达和外分泌的特点。     

透明颤菌血红蛋白基因在金色链霉菌中的克隆与表达

分别用质粒pJJ699与pUC19(vhb),pIJ702与pBR322(vhb),构建大肠杆菌链霉菌穿梭质粒,将透明颤菌血红蛋白基因转入金色链霉菌。在低溶解氧浓度下,透明颤菌血红蛋白的表达,可提高金色链霉菌氧的利用效率,产物合成比原始菌株提高40%～60%。在局部低氧的环境中,采用四环素抗性基因启动子带动血红蛋白基因表达,可有效发挥透明颤菌血红蛋白的氧传递效率,优于透明颤菌血红蛋白基因受溶解氧调控的天然启动子。     

双功能枯草杆菌诱导型高效表达分泌载体的构建与鉴定

利用大肠杆菌质粒pSP72和枯草杆菌质粒pUB18共整合得到双功能克隆载体pSB。在pSB多克隆位点依次引入枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因启动子-信号肽序列sacBp.s.、地衣芽孢杆菌淀粉酶基因终止子序列α-amyT和短小芽孢杆菌增强子基因degQ,最终构建了双功能枯草杆菌诱导型高效表达分泌载体pSBPTQ。将VasostatinⅠ基因作为靶基因检测sacBp.s.、α-amyT和degQ在pSBPTQ进行外源基因表达时的功能,结果表明,在蔗糖诱导下,sacB启动子有效启动了Vasostatin I基因的表达和分泌,α-amy T提高了VasostatinⅠ基因的转录效率,而degQ明显增强了VasostatinⅠ基因的表达水平。VasostatinⅠ基因在蔗糖诱导下成功表达并分泌到枯草杆菌细胞外,蛋白质分泌效率达到90%左右。质粒稳定性试验结果表明,经过40个世代之后,质粒pSBPTQ在枯草杆菌DB1342中仍旧保持在83%以上。     

枯草杆菌克隆体系的研究

为了重组基因能良好地表达,需要发展多种克隆体系。本文综述了枯草杆菌作为克隆载体的优点,枯草杆菌中天然质粒的筛选,异源质粒的引入,一系列重组质粒的构建,噬菌体载体的发展,DNA分子与转化的关系,原生质体的转化及外源基因在枯草杆菌体系中的表达等方面的研究概况。     

枯草杆菌克隆体系的研究

为了重组基因能良好地表达,需要发展多种克隆体系。本文综述了枯草杆菌作为克隆载体的优点,枯草杆菌中天然质粒的筛选,异源质粒的引入,一系列重组质粒的构建,噬菌体载体的发展,DNA分子与转化的关系,原生质体的转化及外源基因在枯草杆菌体系中的表达等方面的研究概况。     

透明颤菌血红蛋白基因在提高枯草芽孢杆菌产脂肽功能中的研究

脂肽是一类具有特殊作用的生物表面活性剂。本实验将血红蛋白基因(vhb)置于RDR细菌启动子驱动下的质粒PSET中,构建PSET-RDR-vhb重组质粒,并通过电激作用转入脂肽代谢菌株-枯草芽孢杆菌株(bacillus subtilis)ZW-3中,转化菌株经酶切和PCR电泳检测鉴定,Southern-blot杂交显示部分转化菌株中外源基因插入基因组DNA,采用一氧化碳差异色谱法测定了血红蛋白的表达量。实验进一步对转化菌株的生长曲线、总蛋白量、过氧化氢酶活性、脂肽的产率进行了测定,结果显示,相比于原始菌株,转化菌株数据均有明显提高。     

枯草杆菌表达载体pUB23的构建及地衣杆菌α-淀粉酶基因的表达

将克隆的解淀粉芽胞杆菌强启动子经DNA序列分析后连接到能在枯草杆菌中复制的质粒pUB18上,构建枯草杆菌表达载体pUB23。为了测试构建的表达载体能否表达外源基因,将地衣杆菌抉失了启动子的α-淀粉酶基因接到pUB23上启动子的下游,组建重组质粒,转化枯草杆菌QB1130(amy~-),获得能分泌α-淀粉酶的转化株,证明缺失了启动子的结构基因在pUB23上克隆启动子的启动下获得表达。酶活力测定结果表明,表达水平是用原启动子时的2.5倍.     

第十四届国际微生物学大会的情况介绍(续)

近年来由于在枯草杆菌中克隆表达外源基因的需要,发展了一种称为辅助质粒协同转化的系统。枯草杆菌的感受态细胞转化要求转化的质粒以寡聚体形式存在,否则转化频率将大大下降。假如感受态的受体细胞中存在和将要转化的质粒有部分同源顺序的质     

人egf基因在突变枯草芽孢杆菌WYBS2001中的转化、分泌表达及其产物功能研究

通过紫外线突变诱导获得了对感染致病菌具有显著抑菌作用的枯草芽孢杆菌突变株WYBS2001。采用PCR技术人工合成了175bp的人表皮生长因子（hEGF)的基因片段,并引入Pst I、Hind Ⅲ酶切位点,起始密码子及pUS186载体信号肽序列CTTAGA。经DNA测试分析,合成的片段与人egf基因序列完全一致。然后将其克隆至枯草杆菌分泌型质粒载体pUS186上构建成重组质粒pUSE,并转化枯草杆菌突变菌株WYBS2001,获得转入egf基因的枯草杆菌生态工程菌WYBS2001T。RIA检测结果表明,WYBS2001T阳性工程菌培养的上清液中可检测到hEGF。含量为7.6ng/ml,如果培养液中添加蛋白酶抑制剂可提高hEGF检测量,通过多代的培养仍然能够稳定地分泌表达hEGF。生物学功能实验表明,分泌的hEGF对人K562体外培养细胞的增殖和生长具有明显生物学活性。对烧伤动物模型的功能性实验观察到,WYBS2001T工程菌制剂对动物的烧伤有明显的治疗作用,该研究表明,微生态基因工程菌有很好的应用前景。