锅柄式PCR及其在混合谱系白血病基因断裂区中的应用

染色体11q23的混合谱系白血病(MLL)基因的断裂点簇集群区(BCR)的转位,可引起婴儿急性白血病及与DNA拓扑异构酶Ⅱ抑制剂的生化治疗法相关的白血病。由于MLL基因包括大约30个不同的转位伴侣基因,几个断裂点所在的伴侣基因的序列还不清楚,因而对MLL基因断裂点的PCR克隆是很困难的。锅柄式PCR,即用已知5'端序列和未知的3'端伴侣基因序列以形似一个锅和一个柄的模板扩增断裂点基因DNA,是一种克隆MLL基因断裂区的新方法,可以扩增未知3'端序列的断裂点簇集群区。     

志贺菌福氏2a入侵上皮细胞诱导表达的毒力相关基因筛选与鉴定

采用体内表达技术的研究策略筛选了志贺菌福氏2a侵入上皮细胞后诱导表达的基因,用基因突变技术进一步对它们的功能进行了鉴定.结果共筛选到13个胞内诱导基因,其中2个DNA甲基化相关基因、1个代谢相关基因、1个转录调控基因、3个插入成分、3个反义转录体、3个未知功能基因.突变体分析发现,3-甲基糖基化酶,柠檬酸裂合酶的编码基因和未知功能基因wcaJ的突变体在细胞和动物感染实验中都显示其存活增殖能力的降低,表明这些基因可能参与了志贺菌在上皮细胞内的存活和增殖.同时也表明,这种在上皮细胞内的存活增殖能力是志贺菌主要的毒力体现之一.但是,未知功能基因yaiC的突变体只在动物体内表现出明显的毒力缺陷,在上皮细胞内没有明显的增殖缺陷,这表明yaiC基因参与其他毒力作用机制.研究结果对深入认识志贺菌的致病机理有重要意义.     

简并PCR及其应用

简并PCR技术是根据同源蛋白的氨基酸序列扩增到同源基因的核苷酸序列,具有独特的优点。成功进行简并PCR的关键是设计好两组引物库和对反应条件进行优化。由于简并PCR自身的特点,在新基因的克隆、基因表达检测、病毒检测和基因组研究中有其广泛而独特的应用。     

鉴定痢疾杆菌毒力基因的SW480细胞模型构建

信号标签诱变技术（STM）是一种在体内高通量筛选病原体毒力基因的新方法,在应用时的一个先决条件是要建立合适的体内筛选系统。为将该技术应用于福氏痢疾杆菌,我们使用三个福氏痢疾杆菌菌株进行了预试验：通过同源重组构建而成的带有氯霉素抗性且aroA和virG基因失活的突变株RC426;因在侵袭质粒上自发缺失3个基因座(ipaBCDA, invA 和 virG)的另一减毒突变株T32,其曾被用作福氏痢疾杆菌的口服疫苗;还有具侵袭宿主细胞能力的野生性菌株2457T。将RC426、T32和2457T混合后侵袭结肠细胞系SW480,不同时间回收经侵袭后细胞裂解液中的菌体并统计。结果显示在侵袭12h内回收到减毒突变株的量与野生有毒株存在显著性差异,表明SW480 细胞系可用于痢疾杆菌的STM研究。Abstract: Signature-tagged mutagenesis (STM) is a novel technology with high throughput screening ability to identify virulent genes of pathogen in vivo. An appropriate animal or cell line model is one of prerequisites by exploiting this technique. In order to apply STM to Shigella flexneri, RC426 was constructed as an attenuated mutant with chloramphenicol resistance and aroA and virG genes inactivated by homologous recombination; Another attenuated strain T32 was used as an oral S. flexneri 2a vaccine due to a spontaneous deletion in three loci (ipaBCDA, invA and virG) on the virulence plasmid. The wild type strain 2457T had the invasion ability into host cells. The three strains, RC426, T32 and 2457T, were mixed together to invade colon cancer cell line SW480, and the distinct strains were recovered and counted from cell lysates of invaded SW480 in different time. The results showed that there were statistically significant differences between the amounts of two attenuated strains recovered and that of virulent strain within 12h invasion, indicating SW480 was a suitable cell model for applying STM to screen virulent genes of Shigella flexneri.     

微生物功能基因组学研究

自从1995年流感嗜血杆菌的基因组序列测定完成之后[1],目前已有75种(株)微生物的基因组完成测序,160多种(株)微生物的基因组测序正在进行中[2]。随着各种微生物基因组测序工作的不断完成和序列信息的积累,微生物基因组学研究的重点已由结构基因组学向功能基因组学转移。微生物功能基因组学研究不仅要阐明微生物基因组内每个基因的作用或功能,还要研究基因的调节及表达谱,进而从整个基因组及其全套蛋白质产物的结构、功能、机理的高度去了解微生物生命活动的全貌,揭示微生物世界的各种前所未知的规律,并使之为人类和社会服务。与真核生物相比,虽然微生物的基因组相对简单,但微生物基因组学研究仍具有重大的科学和经济意义。在细菌基因组中,既有编码在极端环境下起催化作用的酶的基因,也有编码分解化学污染物的酶的基因,这些基因在真核细胞是不存在的。通过微生物功能基因组学研究,还能发现药物靶位和疫苗抗原。微生物基因的功能及表达研究结果也能为研究复杂生物的基因功能提供参考。近些年微生物功能基因组学研究受到了普遍重视。日本组织了十几所大学和研究机构,计划用5年时间完成大肠杆菌的功能基因组研究[3]。日本还与欧洲联合正在开展枯草杆菌功能基因组学研究[4]。其它微生物的功能基因组学研究也在进行中。由于微生物的种类繁多,功能基因组研究的内容又较丰富,要全面介绍微生物功能基因组学研究是困难的。本文仅从未知功能基因的鉴定、药物靶位及疫苗抗原研究、致病机制研究、生物功能图谱研究4个方面进行简要的评述。     

一种体内研究病原体致病机理的新方法——信号标签诱变技术

信号标签诱变技术是以整个基因组为基础的研究病原体致病机制,可在体内对毒力基因进行高通量筛选的一种新方法。近几年应用该技术已对十多种病原微生物进行了筛选。这些筛选中除了找到已知的毒力基因外,还都鉴定到了未知的毒力因子。本文就该技术的原理、优缺点、应用的必要条件、技术的改进及应用该技术鉴定到的毒力基因等作一综述。 A Novel Approach to Study Pathogenesis of Pathogens in vivo——Signature-tagged Mutagenesis YAO Xiao1,2,HUANG Liu-yu1,YANG Bo-lun2,SU Guo-fu1 1.Beijing Institute of Biotechnoloy,Beijing 100071,China; 2.College of Environmental and Chemical Engineering,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710049,China Abstract:Signature-tagged mutagenesis (STM) is a novel approach to study pathogenesis of pathogens and to screen virulence genes with high throughput in vivo,which is based on whole genome of pathogen in question.In resent years,more than ten species of microbial pathogens have been screened with this technology.There are also unknown virulence factors being identified with exception of known virulence genes identified in all these screens.This article reviews the principle,advantages and current limitations,the requirements,modifications of STM,and to date virulence genes identified by this technology. Key words：signature-tagged mutagenesis;virulence genes;pathogens;in vivo     

牛β-乳球蛋白基因的克隆及其调控外源基因表达的研究

目的制备乳腺生物反应器所必需的乳腺特异性表达的调控序列,并验证其指导外源基因表达的能力.方法用PCR法从奶牛染色体上分5段扩增出了全长8.2Kb的牛β-乳球蛋白基因,包括1.8Kb的5′侧翼区、1.7Kb的3′侧翼区及4.7Kb的gDNA区.扩增出的各片段克隆到T-载体上,酶切鉴定及序列分析均证实了所扩增片段的正确性.将五个片段与荧光素酶cDNA拼接成荧光素酶瞬时表达载体并在小鼠乳腺中瞬时表达.结果注射荧光素酶瞬时表达载体的小鼠乳汁中明显测出了荧光素酶活性.结论所克隆的牛β-乳球蛋白基因表达调控序列能够指导外源基因在小鼠乳腺中表达.     

病原微生物致病岛的研究

致病岛是病原微生物通过基因水平转移获得的外源DNA,它是在研究致病性肠道菌的基因组结构和致病性的基础上发展起来的,并在其他革兰氏阴性和阳性致病菌中得到证实。本就各类病原菌致病岛的研究近况作一综述,同时介绍了致病岛的特征,讨论了致病岛在微生物进化中的意义及与tRNA基因的关系。     

肠毒素性大肠杆菌CS3纤毛抗原在痢疾菌中的表达及其免疫效果研究

首先通过体内外重组的方法,构建了福氏2a痢疾菌T32asd基因缺陷的突变体FaD,作为抗原载体菌;同时,构建包含asd基因的表达质粒pYX102,与FaD一起,构成宿主-载体平衡致死系统,用于在没有抗生素条件选择的情况下,稳定表达克隆在表达质粒上的外源抗原基因.将肠毒素性大肠杆菌的CS3菌毛抗原基因克隆至pYX102,构建成重组表达质粒pYX103,ELISA检测结果证实CS3在痢疾菌中可以很好地表达.免疫小鼠后可诱生相应的抗体,虽然口服免疫和注射免疫产生的CS3抗体效价有一定差别,但对痢疾菌的毒株攻击均可提供较好保护.该结果为细菌性腹泻疫苗的研制提供了候选株.     

牛β-乳球蛋白基因的克隆及部分序列测定

为了制备乳腺生物反应器所需要的乳腺特异性表达的调控序列,用ＰＣＲ法从奶牛染色体上分５段扩增出了全长的牛 ＢＬＧ基因约 ８ ｋｂ,包括 １．８ ｋｂ的 ５’侧翼区、１．７ ｋｂ的 ３’侧翼区及 ４．７ ｋｂ的ｇＤＮＡ区。扩增出的各片段克隆到Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ上,酶切鉴定及序列分析均证实了所扩增片段的正确性。