Red重组系统及在微生物基因敲除中的应用

在完成了对各种微生物基因组的测序以后,功能基因学的研究变得尤为重要。研究基因功能最直接的方法便是将待研究的基因失活。最初构建基因突变体是采用大肠杆菌的RecA系统,但是RecA重组系统操作复杂,重组效率低。最近建立了Red重组系统,该系统由3个蛋白组成：α蛋白(即λ核酸外切酶),β蛋白,Gam蛋白。应用Red系统进行基因敲除,可以直接利用线性打靶DNA,两侧同源臂长度在35~60 bp即可发生同源重组,且重组效率高。 Abstract:Since many DNA-sequencing projects of varied microorganisms have been completed,studies on their functional genomics become more important.Inactivation of an interesting gene is a direct method to characterize its function.Though the Esherichia coli RecA recombination system can be used to produce gene mutants,it needs a complex manipulation process.Furthermore,its efficiency is very low.Recently a Red recombination system was developed.This recombination system consists of three proteins:α protein（λ exonuclease）,β protein and Gam protein.In this system,the linear targeting DNA which contains a selectable marker flanked with a homologous region as short as only 35~60 bp can be directly targeted for gene knock-out with a higher efficiency.     

新型促细胞粘附重组人源性胶原的原核表达及功能性研究

选择一段与COL1A1基因相应序列同源、适合于在大肠杆菌E.coli中表达、含有编码促细胞粘附位点GER三肽密码子的基因序列。利用RT-PCR技术自人组织扩增该序列,构建pET28a(+)-COL重组表达质粒并转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。IPTG诱导表达获得重组人源性胶原RHDC, 表达量达到菌体总蛋白的40%左右。SDS-PAGE和Western Blot结果推测该胶原具有三螺旋结构。细胞粘附试验证明RHDC具有促细胞粘附能力,具有应用在生物材料领域的潜力。     

志贺菌福氏2a入侵上皮细胞诱导表达的毒力相关基因筛选与鉴定

采用体内表达技术的研究策略筛选了志贺菌福氏2a侵入上皮细胞后诱导表达的基因,用基因突变技术进一步对它们的功能进行了鉴定.结果共筛选到13个胞内诱导基因,其中2个DNA甲基化相关基因、1个代谢相关基因、1个转录调控基因、3个插入成分、3个反义转录体、3个未知功能基因.突变体分析发现,3-甲基糖基化酶,柠檬酸裂合酶的编码基因和未知功能基因wcaJ的突变体在细胞和动物感染实验中都显示其存活增殖能力的降低,表明这些基因可能参与了志贺菌在上皮细胞内的存活和增殖.同时也表明,这种在上皮细胞内的存活增殖能力是志贺菌主要的毒力体现之一.但是,未知功能基因yaiC的突变体只在动物体内表现出明显的毒力缺陷,在上皮细胞内没有明显的增殖缺陷,这表明yaiC基因参与其他毒力作用机制.研究结果对深入认识志贺菌的致病机理有重要意义.     

痢疾杆菌体内诱导基因筛选方法的建立

分别用氯霉素乙酰转移酶基因(cat)和天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)作为报告基因,用小鼠肺感染模型和HeLa细胞侵袭模型来试验筛选痢疾杆菌体内诱导基因的可行性。结果表明,以asd为报告基因,用HeLa细胞侵袭试验作为筛选模型,可成功地用于筛选痢疾杆菌的体内诱导基因。     

Red重组系统在痢疾杆菌基因敲除中的应用研究

利用λ噬菌体的Red系统在细菌中进行基因敲除的技术,最近发展较快,但多在大肠杆菌中进行。以alkA、wcaJ、yphF和dam 4个基因为例,分别在大肠杆菌和痢疾杆菌中利用Red系统进行基因敲除。对于大肠杆菌,除dam基因外,其余3个基因均能被有效敲除,而在痢疾杆菌中只能敲除一个alkA基因。结果表明,为使该系统能有效地应用于痢疾杆菌和其它细菌,还需对该系统进行改进。     

笼养东方白鹳春季行为和时间分配的研究

笼养东方白鹳春季日节律行为和时间分配的研究结果表明 :其各种行为的时间分配不同 ,并出现较明显的日节律。节律变化与饲养方式和笼舍环境等因素有关 ,性别、年龄、繁殖与否等影响其时间分配。     

华北石质山区油松林对降水再分配过程的影响

森林通过降水再分配过程影响着流域的水量平衡和物质循环。根据2005-2008年汛期华北石质山区主要造林树种油松林的林外降雨、穿透降雨、树干径流定位观测数据,探讨了人工油松林对降雨再分配过程的影响。结果表明,测定期间32场次降雨过程中油松林穿透雨量、树干径流量和林冠截留量平均值分别为8.67,0.11,1.07mm;透过率,树干径流率和林冠截留率分别为82.18%(57.74%-87.55%),1.07%(0.22%-2.07%),16.75%(11.01%-42.07%)。油松林冠层穿透降雨量、树干径流量和林冠截留量均与林外降雨量呈明显的线性关系(R2=0.995,R2=0.907,R2=0.855),根据回归方程,当林外降雨量大于0.3mm时,可发生穿透降雨,当林外降雨量大于3.51mm时,可发生树干径流;林冠截留率与林外降雨呈双曲线衰减趋势,回归方程为y=12.091+55.537/(x+0.426)(N=32,R2=0.685)。典型次降雨再分配过程表明,林冠不仅在量上对降雨进行再分配,还在时程上进行了再分配。     

一种简单高效的结合转移克隆方法

为了建立一种将整合在染色体上的重组自杀质粒重新环化成环形质粒的技术方法,以体内表达技术筛选到的痢疾杆菌融合菌株为出发点,借助辅助质粒pMT999或pRX2013进行了结合转移实验,成功地建立了一种结合转移克隆方法,并且具有较高的克隆效率。