白藜芦醇微粉的制备、表征与抗氧化功能评价

实验利用超临界SAS法使白藜芦醇在超临界状态下反溶剂重结晶,来制备白藜芦醇微粉借助超临界反溶剂法(SAS)来减小白藜芦醇的粒径从而提高其抗氧化能力。制备的条件为:反应温度为50℃,反应压力为20MPa,白藜芦醇乙醇溶液的浓度为9 mg·m L-1,给药速度为1 m L·min-1。利用激光粒度仪和扫描电镜检测白藜芦醇微粉,结果显示白藜芦醇粉体较原粉粒径大大降低,平均粒径为0.68±0.03μm。而后通过了傅里叶红外光谱、X衍射仪、高效液相色谱和质谱检测白藜芦醇微粉和原粉的各项特性。结果显示SAS过程并没有改变白藜芦醇的化学结构,但白藜芦醇微粉的结晶度大大降低,白藜芦醇的纯度也从原粉的98.5%纯化为微粉的99.2%。利用果蝇抗衰老实验来检测白藜芦醇的抗氧化能力。结果表明在白藜芦醇溶液浓度为,2.5、5和10 mg·m L-1时,白藜芦醇微粉的抗氧化能力均高于原粉和空白实验。这说明白藜芦醇的不但具有抗氧化能力,而且白藜芦醇微粉在效果上优于白藜芦醇原粉。这为提高白藜芦醇品质提供了依据。     

白藜芦醇减轻神经元氧化应激损伤的作用机制研究

目的:观察白藜芦醇(RSV)对过氧化氢(H2O2)所致的海马神经元HT22细胞损伤的保护作用,并探讨超氧化物歧化酶2(Mn-SOD)在其中的作用。方法:采用体外培养HT22小鼠海马神经元细胞系,H2O2作为损伤因素模拟氧化应激损伤。将细胞分为5组,分别为正常培养组(Control)、150μM H2O2损伤组(H2O2)、25μM白藜芦醇保护组(RSV+H2O2)、SOD2-si RNA干扰组(SOD2-si RNA+RSV+H2O2)和乱序RNA组(SC-si RNA+RSV+H2O2),药物暴露24 h后,应用MTT法检测HT22细胞活力、比色法检测乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)释放量、相差显微镜观测细胞形态。结果:与对照组相比,H2O2组的活力显著下降(P0.05),LDH释放量明显增加(P0.05),细胞形态明显破坏;25μM的RSV显著恢复了HT22细胞的活力、减少了LDH释放、改善了细胞形态,而SOD2-si RNA显著逆转了RSV引起的上述保护作用,乱序RNA(SC-si RNA)未对上述保护作用产生明显影响。结论:白藜芦醇可能通过上调SOD2减轻H2O2对HT22细胞的氧化应激损伤。     

花生中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取及含量测定

建立高效液相色谱紫外法同时测定花生中白藜芦醇和白藜芦醇苷含量的方法。以85%乙醇水溶液为提取剂,采用直接超声提取、高速匀浆提取和固相萃取3种不同提取方法处理花生样品,对提取剂使用量和提取方法进行比较研究,高效液相色谱法进行含量测定。结果表明：当提取剂使用量为40mL时,固相萃取提取法效果最好,白藜芦醇的加标回收率为96.00%~109.55%,相对标准偏差（RSD）为1.64%~2.17%,检出限为0.016mg/kg;白藜芦醇苷的加标回收率为91.82%~104.67%,相对标准偏差（RSD）为1.73%~2.81%,检出限为0.052mg/kg。测定的山东省210个花生样品中白藜芦醇含量为0.17~11.39mg/kg,含量最低的是花育22,最高的是白玉品种;白藜芦醇苷含量为0.22~1.44mg/kg,含量最低的是春甜,最高的是山花9号品种。该方法适合于花生样品中白藜芦醇和白藜芦醇苷含量的测定。     

新型β-葡萄糖苷酶BglD2异源表达及水解虎杖苷能力

从海洋细菌Bacillus sp.D1中克隆、重组表达β-葡萄糖苷酶BglD2,研究其酶学性质,并对其水解虎杖苷制备白藜芦醇的能力进行分析。BglD2的最适催化温度和pH分别为45℃和6.5,在30℃和pH 6.5条件下的半衰期约为20 h。BglD2能够水解含β(1→3)、β(1→4)、β(1→6)等键型的多种底物。BglD2具有良好的糖促活特性,100 mmol/L葡萄糖和150 mmol/L木糖分别将酶活力提升2.0倍和2.3倍。BglD2具有较好的乙醇促活及耐受特性,30℃时,10%乙醇使酶活力提升1.2倍,25%乙醇存在时其仍保留60%的酶活力。BglD2具有水解虎杖苷制备白藜芦醇的能力,35℃条件下反应2 h水解率为86%。具有乙醇耐受及抗产物抑制等特性的β-葡萄糖苷酶BglD2在酶法水解虎杖苷制备白藜芦醇方面有应用潜力。     

白藜芦醇体外对肝癌HepG2细胞分化及P21^WAF1/CIP1表达的影响

目的：探讨白藜芦醇（Resvratrol,Res）在体外对肝癌细胞分化及相关周期蛋白依赖激酶抑制因子P21^WAF1/CIP1的影响。方法：体外培养肝癌HepG2细胞,用MTT法检白藜芦醇对HepG2细胞的生长抑制作用,用倒置显微镜观察肝癌细胞的形态改变,用放射免疫法检测其AFP分泌,以RT-PCR方法检测HepG2细胞中P21^WAF1/CIP1mRNA的表达,用免疫细胞化学检测其P21^WAF1/CIP1蛋白的表达。结果：白藜芦醇呈时间剂量性抑制HepG2细胞株的增殖,使其亚细胞结构趋于正常,AFP分泌量下降,并显著上调HepG2细胞中P21^WAF1/CIP1mRNA和蛋白的表达。结论：白藜芦醇能诱导HepG2细胞在体外向正常肝细胞分化,并上调其P21^WAF1/CIP1的表达。     

酶法提取葡萄穗轴中原花色素、白藜芦醇的研究

将纤维素酶用于葡萄穗轴中原花色素和白藜芦醇的提取工艺中.即在乙醇提取前,先用纤维素酶处理葡萄穗轴粗粉.通过实验确定最佳的酶解条件为:酶解体系pH 6,酶解温度30 ℃,酶解时间80 min,m(纤维素酶):m(葡萄穗轴粗粉)=1∶ 250.实验还对酶解后乙醇提取条件进行优化:40%乙醇溶液为提取剂,提取温度80 ℃,提取时间120 min.提取液通过溶剂萃取进行分离,用香草醛-盐酸法和紫外分光光度法分别测定其中原花色素和白藜芦醇的含量.与传统直接醇提法相比,原花色素的提取率提高了近4倍,白藜芦醇的提取率也有所提高.     

凝胶柱层析分离虎杖中白藜芦醇的研究

本论文初步探讨了虎杖中白藜芦醇分离纯化的工艺条件,比较了不同溶剂、不同浓度、不同流速洗脱条件下白藜芦醇样品在LH-20凝胶层析柱上的分离效果,以及虎杖的乙醇提取液通过氯仿、乙酸乙酯萃取,凝胶柱层析分离后的成分变化,实验表明,当以甲醇为洗脱液,浓度为60%,流速为0.5 mL/min时,白藜芦醇样品的分离效果最好.采用中压液相色谱检测收集到的白藜芦醇纯度(以白藜芦醇峰面积占总峰面积计算)可达80.34%,回收率达86.16%.     

农杆菌介导白藜芦醇合酶基因转化蔓茎堇菜的研究

目的:通过农杆菌介导法将白藜芦醇合酶基因转化蔓茎堇菜,并对转化条件进行优化.方法:以蔓茎堇菜叶柄为受体材料,采用叶盘法进行遗传转化,实验过程中对影响转化的一些主要因素进行筛选研究.结果:最佳的侵染条件为OD6000.3的菌液侵染10min,头孢霉素的适宜浓度为250mg/L.转化后的蔓茎堇菜外植体经3.0mg/L潮霉素筛选,最终得到9株抗性再生苗,转化频率为0.98%.结论:该研究为建立一个农杆菌介导白藜芦醇合酶基因转化蔓茎堇菜的遗传体系提供了基础.     

白藜芦醇甙减轻高糖所致心肌微血管内皮细胞损伤的作用及机制研究

目的:探讨白藜芦醇甙在高糖处理的大鼠心肌微血管内皮细胞损伤中的作用及其可能调控机制。方法:酶消法分离大鼠CMECs,高糖处理CMECs建立细胞损伤模型,实验随机分为6个组:对照组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)、白藜芦醇甙组、高糖组(葡萄糖浓度为33 mmol/L)、高糖+白藜芦醇甙组、高糖+白藜芦醇甙+3-MA(自噬抑制剂)组和高糖+雷帕霉素(自噬诱导剂)组。白藜芦醇甙组和高糖+白藜芦醇甙组分别加入10μmol/L的白藜芦醇甙孵育24 h,高糖+白藜芦醇甙+3-MA组加入10μmol/L的白藜芦醇甙和10μmmol/L 3-MA孵育24 h,高糖+雷帕霉素组加入100 nmol/L的雷帕霉素孵育24小时。CCK-8实验检测大鼠CMECs增殖;Tunel法检测大鼠CMECs凋亡;FITC-葡聚糖清除实验检测单层CMECs通透性;Western blot检测LC3Ⅱ和p62的表达。结果:与对照组和白藜芦醇甙组相比,高糖组CMECs增殖能力降低(P<0.05),凋亡率显著增加(P<0.05),细胞通透性增加(P<0.05),LC3Ⅱ表达降低(P<0.05),p62的表达增加(P<0.05);与高糖组相比,高糖+白藜芦醇甙组和高糖+雷帕霉素组CMECs增殖能力增加(P<0.05),凋亡率显著降低(P<0.05),细胞通透性降低(P<0.05),LC3Ⅱ表达增加(P<0.05),p62的表达降低(P<0.05);与高糖+白藜芦醇甙组相比,高糖+白藜芦醇甙+3-MA组CMECs增殖能力降低(P<0.05),凋亡率显著增加(P<0.05),细胞通透性增加(P<0.05),LC3Ⅱ表达降低(P<0.05),p62的表达增加(P<0.05)。结论:白藜芦醇甙通过增加自噬减轻高糖处理的大鼠心肌微血管内皮细胞损伤。