根癌农杆菌介导的虎杖茎尖转化研究

为了建立根癌农杆菌介导的虎杖茎尖遗传转化体系,以虎杖的茎尖为转化受体,研究了携带白藜芦醇合酶基因(PcRS)的根癌农杆菌载体介导的虎杖遗传转化若干因素对转化效果的影响。结果显示,较适宜的转化系统为预培养2 d,农杆菌菌液(OD600值为0.6)侵染10 min,共培养3 d,在含8 mg/L潮霉素的培养基上诱导不定芽。利用该体系从300块茎尖外植体中共转化获得15株抗性再生植株,经PCR和Southern杂交检测,有6株虎杖的基因组中已整合进了目的基因。     

羽衣甘蓝下胚轴农杆菌介导遗传转化体系的优化

以红鸥羽衣甘蓝下胚轴为试材,首先优化了不定芽分化体系,其次探讨了农杆菌介导遗传转化过程中农杆菌侵染浓度、侵染时间对不定芽分化率的影响及不定芽分化和生根过程中潮霉素B筛选压力,最后对抗性植株进行了潮霉素B筛选基因的PCR检测。结果表明,在MS+6-BA 5.0 mg/L+Ag NO3 9.0 mg/L培养基中不定芽分化率最高,为84.17%;农杆菌侵染浓度OD600值为0.5、侵染5 min时利于遗传转化,分化率为69.17%;不定芽分化和生根过程中潮霉素B筛选压力分别为4.0 mg/L和30.0 mg/L;潮霉素B筛选基因的PCR鉴定结果,在预期的602 bp处出现了条带,初步证明潮霉素B筛选基因已整合到羽衣甘蓝基因组中。     

农杆菌介导的刺芹侧耳遗传转化体系的建立

以刺芹侧耳菌丝球为受体,潮霉素（Hyg）为筛选标记,应用农杆菌介导法对刺芹侧耳菌丝进行了遗传转化研究。潮霉素敏感性测试结果表明,刺芹侧耳Hyg耐受浓度为50mg/L。农杆菌介导的刺芹侧耳菌丝最佳遗传转化体系为：菌液浓度OD₆₀₀=0.6-0.7,侵染时间30-35min,共培养时间2d,侵染液和共培养培养基中乙酰丁香酮（AS）浓度为1mg/mL;经潮霉素抗性筛选、PCR鉴定和GUS活性的组织化学分析,表明外源基因GUS已转入到刺芹侧耳菌丝中,并获得表达。本实验成功地建立了稳定的农杆菌介导的刺芹侧耳遗传转化体系。     

农杆菌介导的紫花苜蓿高效遗传转化体系的研究

为建立高效的农杆菌介导的紫花苜蓿的遗传转化体系,对影响转化体系的若干因素进行了研究.结果表明,最适宜的条件分别为抗菌素为350 mg/L的羧苄青霉素(Carb);卡那霉素(Kan)筛选的浓度为60 mg/L;基因型为WL-323;外植体为下胚轴;农杆菌菌液浓度OD600值为0.4-0.6;侵染时间10 min;乙酰丁香酮(AS)的浓度为10 mg/L.     

农杆菌介导的胀果甘草愈伤组织遗传转化

目的:旨在建立一个农杆菌介导的甘草愈伤组织遗传转化的可行方案,并对转化条件进行优化。方法:选择EHA105和LBA4404两种根癌农杆菌菌株,热激法转入含有绿色荧光蛋白GFP基因的植物表达载体pBI121-gfp,挑选转化的农杆菌用于侵染胀果甘草愈伤组织。设置不同培养时间的愈伤组织作为受体材料和农杆菌不同侵染时间两组条件,经共培养后的甘草愈伤组织进行荧光检测。结果:愈伤组织在含有100mg/l卡那霉素的继代培养基上进行筛选培养,得到了具有卡那霉素抗性的转化甘草愈伤组织,转化愈伤组织经继代培养基后在紫外光下仍可见绿色荧光,PCR检测转化愈伤组织基因组中含有gfp基因。结论:试验建立了农杆菌介导的甘草愈伤组织的遗传转化体系,为目的基因导入甘草细胞利用基因工程手段调控甘草次生代谢产物生物合成的研究奠定了基础。     

根癌农杆菌介导的金边狗牙根遗传转化条件的优化

为建立根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,菌(L.)Pers.]最佳遗传转化体系,以葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)基因的瞬间表达率为指标,从愈伤组织继代时间、根癌农杆菌侵染时间、负压条件及光照时间等方面进行了筛选.结果表明,根癌农杆菌介导的金边狗牙根最佳的转化体系是:以继代培养2周的愈伤组织为起始材料,根癌农杆菌介导感染10 min,经负压处理(抽拉20次)并在全光条件下共培养转化.     

百合鳞片的诱导分化及遗传转化效率分析

基因工程是改良百合性状的重要手段,建立高效稳定的遗传转化体系是百合转基因研究的基础。以百合地下茎鳞片为外植体,筛选并优化百合的直接和间接再生体系;把含枸杞GR(Glutathione reductase)基因和筛选基因NPTII的载体,利用农杆菌转化法对鳞片和愈伤组织进行转基因操作,采用正交试验,优化转化条件以建立适合不同受体的遗传转化体系。结果表明,各阶段最优培养条件分别为:鳞片诱导和膨大MS+2mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+0.1mg/L NAA(萘乙酸)+ 90g/L蔗糖;鳞片直接分化MS+1.0mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)+0.2mg/L NAA+ 30g/L蔗糖,间接分化MS+2.5mg/L 2,4-D +0.4mg/L TDZ(噻重氮苯基脲)+60g/L蔗糖;百合鳞片的Kana(卡那霉素)选择压为100mg/L,愈伤组织75mg/L。遗传转化体系条件为:鳞片,农杆菌OD₆₀₀=0.6,预培养3d,侵染40min,As(乙酰丁香酮)200μmol/L,阳性植株转化率为17.50%;鳞片分化愈伤组织,农杆菌OD₆₀₀,预培养5d,侵染40min,As 200μmol/L,阳性植株转化率为12.60%。     

PSAG12-ipt嵌合基因转化马铃薯体系的研究

以根癌农杆菌介导法将PSAG12-ipt嵌合基因导入马铃薯栽培品种,对影响马铃薯遗传转化的多种因素进行系统研究.结果表明:马铃薯茎段分化效率高于叶片,马铃薯愈伤诱导和芽分化最适培养基为MS+6-BA 0.25mg/L+NAA 0.25mg/L+2,4-D 0.25mg/L,添加1%Na2SO3能有效防止褐化;茎段愈伤诱导和分化苗生根最适的Kan浓度分别为50mg/L和75mg/L;外植体预培养2d,OD600为0.2～0.5的农杆菌浓度侵染8min、共培养3d后进行选择培养能有效地提高植株再生能力.用PSAG12和ipt双重PCR检测再生植株,阳性转化率为65.8%.Southern blotting结果表明,转基因植株多以单拷贝形式整合进马铃薯基因组中.     

液泡转化酶反义基因对番茄的遗传转化

以'中蔬4号'番茄的子叶为试材,通过农杆菌介导法遗传转化,将液泡转化酶反义基因导入再生植株,经PCR和Southern斑点杂交检测证明,5株转化植株基因组中整合有目的基因.遗传转化最佳条件为:在附加1.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L IAA的MS培养基上再生培养,外植体预培养2 d,菌液浓度OD600=0.5,侵染时间5 min,共培养2 d.遗传转化后,对整合有目的基因的再生番茄叶片液泡转化酶活性测定,表明液泡转化酶活性明显受到抑制.获得的转基因植株为进一步研究液泡转化酶基因的功能奠定了基础.     

发根农杆菌介导的尾巨桉遗传转化体系的建立

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）的建立对植物功能基因的验证具有重要意义,为了在桉树（Eucalyptus）中建立发根农杆菌介导的遗传转化体系,本研究以不同的发根农杆菌菌株侵染尾巨桉（Eucalyptus urophylla × E. grandis）的叶片和茎段,确定合适的农杆菌菌株和外植体类型,在此基础上开展农杆菌浓度、侵染时间对毛状根诱导的影响。结果表明：采用发根农杆菌菌株MSU440,以叶片为外植体进行发根诱导,最高获得了81.0%的毛状根诱导率,毛状根平均根长达到3.23 cm。在发根农杆菌浓度为OD₆₀₀=0.3、侵染时间为30 min时,共培养48 h后经过20 mg·L^-1卡那霉素筛选培养,通过PCR分子鉴定和GUS染色证实外源基因稳定地整合在桉树毛状根基因组中,转化率达20.2%。初步建立了发根农杆菌介导的桉树遗传转化体系,为桉树基因功能鉴定和进一步的转基因育种奠定基础。     

蔓茎堇菜总黄酮提取工艺初探

分别采用热水浸提法、甲醇浸提法和乙醇浸提法来提取蔓茎堇菜样品的总黄酮,并以芦丁为标准品,用紫外分光光度法在265nm处测定各提取液的总黄酮含量。结果表明,甲醇浸提法和乙醇浸提法显著优于热水浸提法,而用70％乙醇为提取溶剂时效果最佳。研究结果可为利用蔓茎堇菜工业化生产黄酮类药用成分提供科学依据。     

黄瓜香水、醇提取液对肠道菌群的调整作用的比较

目的研究不同溶剂提取黄瓜香有效成分的作用效果,以期能更好提高药物的利用度。方法用盐酸林可霉素制造小鼠菌群失调模型,然后分别用黄瓜香的水、醇提取物治疗,比较治疗效果。结果醇提取物和水提取物均能调整肠道菌群平衡,与自然恢复组相比差异有统计学意义(P0.05),且醇提取物组效果要优于水提取物组(P0.05)。结论黄瓜香醇提取物是理想的微生态调节剂。     

抗氧化剂对农杆菌介导的大豆下胚轴GUS基因瞬时表达的影响

大豆(Glycine max)下胚轴作为大豆遗传转化的外植体材料,能快速高频再生不定芽。然而,在遗传转化过程中褐化影响基因转化效率。在该研究中,我们用含有GUS染色基因和hpt II(Hygromycin phosphotransferase II)筛选基因的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404侵染大豆下胚轴,并用组织化学定位法测定了GUS基因的瞬时表达,以确定大豆的优化基因转化条件。结果显示,在共培养基中加入硫代硫酸钠、L_半胱氨酸以及二硫苏糖醇等抗氧化剂,可以有效地抑制大豆下胚轴在组培过程中褐化的发生,并大幅度提高农杆菌在下胚轴的瞬时表达率。这些结果说明抗氧化剂可以降低这种影响并有效提高基因转化效率。     

根癌农杆菌介导的日本曲霉转化体系的建立

【目的】通过根癌农杆菌介导的方法构建日本曲霉转化子库,从而筛选出高产甘没氧化酶的日本曲霉突变菌株。【方法】本文通过三亲杂交的方法将双元载体pBI-hphII转移至根癌农杆菌EHA105中并作为侵染菌株,以日本曲霉As5999为受体菌株,建立了农杆菌介导的日本曲霉转化体系,构建了突变体库,并对影响转化效率的根癌农杆菌浓度,乙酰丁香酮(As)加入与否,共培养时间,共培养温度等因素进行了分析。【结果】对转化子的PCR检测和Southern杂交分析表明,T-DNA已整合进日本曲霉基因组中,随机挑选的9个转化子连续转接10代后均能稳定遗传。【结论】该转化体系的建立为筛选出高产甘油氧化酶的日本曲霉突变菌株奠定了基础。     

Transgenic Arabidopsis plants expressing Agrobacterium tumefaciens VirD2 protein are less susceptible to Agrobacterium transformation

Agrobacterium tumefaciens causes crown gall disease on many plant species and can result in considerable economic losses. Here we report a new strategy to control crown gall disease by over-expressing Agrobacterium tumefaciens VirD2 protein in plants. Transgenic Arabidopsis plants over-expressing virD2 from constitutive or wound-inducible promoters are less susceptible to Agrobacterium -mediated transformation. Additionally, the transient introduction of an A. tumefaciens virD2 gene in tobacco BY-2 cells reduces subsequent Agrobacterium -mediated transformation.     

大豆胚尖遗传转化体系优化及抗逆基因GmPK转化研究

采用GUS基因瞬时表达检测方法,通过正交试验以AS浓度、侵染菌液OD值、侵染时间、共培养时间和恢复培养时间5个因素在4个水平上进行分析,优化了农杆菌介导的大豆胚尖遗传转化体系,并在此基础上进行了抗逆基因GmPK的遗传转化。结果表明,采用共培养培养基中添加100μmol/L AS、侵染菌液OD600值0.9、侵染15h、共培养5d和恢复培养3d的转化条件最佳,GUS阳性率达74.59%,经PCR及RT-PCR进一步验证获得了转基因阳性植株。利用优化的最佳条件进行抗逆基因GmPK的转化,炼苗移栽成活的再生植株经PCR及PCR-Southern blotting验证,初步证明外源基因已经整合至大豆基因组,转化率为0.6%。     

离子注入水稻愈伤组织提高农杆菌转化效率的初步研究

通过ＧＵＳ报告基因表达的组织化学染色分析,我们发现低能氮离子束注入水稻愈伤组织可显著提高根癌农杆菌介转基因效率,这为克服单子叶植物对根癌农杆菌不敏感性、提高遗传转化效率的研究提供了一条新的途径。     

农杆菌介导GUS基因对多年生黑麦草转化的研究

通过检测愈伤组织中GUS基因的瞬间表达,研究农杆菌LBA4404/pCAMBIA1301介导多年生黑麦草的转化体系。通过对多年生黑麦草瞬间表达率的比较,确立了其遗传转化的最佳优化条件。研究发现,多年生黑麦草不同品种的转化率在25%~45%之间变化。多年生黑麦草遗传转化最佳优化条件是预培养10d的胚性愈伤组织、浓度为0.5~0.8OD的农杆菌菌液以及2d共培养时间。在共培养基中添加100μmol/L乙酰丁香酮能有效地提高植物瞬间表达率。两种侵染处理方法比较结果为滤纸滴加法比浸泡法更优。转化后对愈伤组织的干燥处理能抑制农杆菌过度繁殖,能改善愈伤状态,有利于提高转化率。     

<Emphasis Type="Italic">Agrobacterium</Emphasis>-mediated genetic transformation of grapevine (<Emphasis Type="Italic">Vitis vinifera</Emphasis> L.) with a novel stilbene synthase gene from Chinese wild <Emphasis Type="Italic">Vitis pseudoreticulata</Emphasis>

A novel stilbene synthase gene (STS), cloned from Chinese wild Vitis pseudoreticulata (W. T. Wang) and responsible for synthesis of the phytoalexin resveratrol in grapevine, was successfully transferred into V. vinifera L. cv. Thompson Seedless via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Using transformation procedures developed in the present study, 72% GFP-positive germinated embryos were produced with about 38% of transformed embryos regenerated into normal plantlets. Integration of the STS gene into the transgenic plants was verified by PCR and Southern blot analysis. Expression of the STS gene was detected by high performance liquid chromatography (HPLC), which showed that the resveratrol concentration in the transgenic plants was 5.5 times higher than that in non-transformed control plants. Chaohong Fan and Ni Pu contributed equally to this work.     

桃ACO基因反义转化桃幼胚子叶的研究

用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens )和基因枪两种方法,以桃(Prunus persica L. Batsch)幼胚子叶为受体,转化桃ACC氧化酶（ACO）反义基因片段,经筛选培养获得了卡那霉素抗性芽。微芽嫁接培养抗性芽部分可成株。PCR、Southern 杂交和GUS基因表达等分子检测,初步表明外源反义ACO基因已经整合到桃基因组中。