人热休克蛋白90AB1基因克隆、原核表达、中试发酵及纯化

通过克隆人热休克蛋白90AB1基因(Hsp90AB1),构建其原核表达载体pET28a(+ )-hHsp90AB1,表达纯化获得目的蛋白,为hHsp90靶向药物筛选奠定基础.提取宫颈癌HeLa细胞总RNA,并经RT-PCR获得hHsp90AB1-cDNA.以hH-sp90AB1-cDNA为模板进行PCR体外扩增,胶回收纯化hHsp90ABl.将hHsp90AB1及pET-28a(+)质粒经Nde I和Sal I双酶切、胶回收纯化酶切片段后,体外连接酶切片段,使其定向重组,再将重组DNA转化DH5α,经复苏后,在含卡那霉素的LB固体养基上筛选出阳性克隆.挑取LB固体培养基上的单菌落经酶切及测序鉴定,证实为阳性克隆,即pET28a-hHsp90AB1体外重组成功,命名为pET28a(+ )-hHsp90AB1.重组质粒转化Rosetta( DE3)菌株,IPTG诱导表达,并对表达条件优化,以及通过SDSA-PAGE和Western blotting分析均表明Hsp90AB1蛋白得到了正确的表达,且表达产物以可溶性形式存在,优化条件下蛋白表达量约占菌体总蛋白13％.接种到18 L发酵罐中试发酵,表达产物经Ni-NTA凝胶素和层析,蛋白纯度达到98％.     

地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶基因克隆与表达特性

目的建立高产量和高活力的地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶基因表达体系。方法采用PCR技术克隆获得目的基因,将其连入表达质粒pET-32 a构建原核表达重组质粒,经测序鉴定后,转化BL21大肠埃希菌,不同温度下IPTG诱导表达融合蛋白,测定酶活;进一步对该基因和编码蛋白进行同源性比较和酶学性质分析。结果碱性蛋白酶基因序列全长1 149 bp,编码382个氨基酸,同源性为99%,融合蛋白分子质量为62 kD,蛋白酶酶活为29 000 U/mL,并且在25℃时是以可溶蛋白形式表达,37℃时部分蛋白以包涵体形式存在。结论此种表达体系可以成功表达具有生物活性的碱性蛋白酶,诱导温度对蛋白酶存在形式具有较大影响。     

孝顺竹肉桂醇脱氢酶基因的克隆及表达研究

肉桂醇脱氢酶(cinnamoyl alcohol dehydrogenas,CAD)是木质素生物合成过程中的一类关键酶.采用RT-PCR及RACE方法从孝顺竹笋中分离出CAD基因家族的一个基因,cDNA全长是1131 bp(GenBank注册号为GU985522),含有一个1 107 bp的读码框,编码一个368 aa...     

蜜蜂TPI基因克隆与生物信息学预测

利用电子克隆方法获得蜜蜂(Apis mellifera)磷酸甘油醛异构酶(triosephosphate isomerase,TPI)基因,并采用生物信息学方法对该基因编码蛋白从等电点、疏水性/亲水性、二级结构等进行了预测,以及试验验证,结果表明蜜蜂TPI基因全长为1 768 bp,具有完整的开放阅读框架(ORF),并得到了试验证实.     

河北承德地区两个温泉中细菌的多样性分析

通过构建16S rDNA克隆文库,对承德地区两温泉中的细菌多样性水平及系统发育关系进行了初步研究。研究表明:68°C的A11文库中阳性克隆的16S rDNA序列分属5个细菌类群,分别为Firmicutes(6.25%)、Deinococcus-Thermus(25.0%)、Gammaproteobacteria(12.5%)、Betaproteobacteria(50.0%)、Alphaproteobacteria(6.25%);而74.5°C的A12文库仅属于一个细菌类群:厚壁菌门(Firmicutes)。两温泉中细菌多样性的差异表明,温度是影响温泉中细菌多样性水平的重要因素。此外,A11文库中克隆的16S rDNA序列与许多已知的可产色素的好氧菌相似性很高,而A12文库中的细菌多数为专性厌氧或兼性厌氧型,其中厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)中的Anoxybacillus flavithermus可以作为研究泉华形成的理想材料。     

地芽孢杆菌Y565-5分离鉴定及其木糖异构酶基因xylA的克隆表达和酶学性质

从甘肃玉门油田地表土中分离到一株嗜热木糖利用菌,地芽孢杆菌Y565-5。利用PCR方法从该菌株中克隆得到一个木糖异构酶基因,xylA。该基因开放阅读框长1182 bp,编码394个氨基酸,XylA氨基酸序列与Geobacillus sp.Y412MC52相似性达到99%。将xylA基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,得到重组质粒pET-28a(+)-xylA,然后将此重组质粒转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE电泳检测出明显的45 kD(相对分子质量)特异性蛋白质条带,并且通过半胱氨酸咔唑法检测出表达产物具有木糖异构酶的活性。对其酶学性质的研究发现,XylA最适温度为90°C,最适pH值为8.0。     

高浓度酒精废水厌氧处理工程系统中古菌多样性及其代谢特征

颗粒污泥形成快、抗冲击能力强、悬浮性好是新型高浓度有机废水厌氧处理系统的重要特征。为了研究颗粒污泥中古菌组成多样性及其功能特征, 采集活性污泥样品, 提取总基因组DNA, 应用PCR-DGGE和16S rDNA克隆测序技术对系统内古菌群落进行研究。结果表明: 古菌克隆文库中克隆子的近缘种归属于Methanosaeta、Methanosarcina、Methanobacterium和Methanomethylovorans 4个类群, 所占文库容量比例依次为58.2%、23.6%、12.7%和3.6%, 1个克隆子未能找到相似菌株, 占1.8%。系统发育分析找到了未知克隆子C10、C11、C13和C19的相似菌株FJ618821、AB479397、AJ244290和AB447878, 并明确相应的分类地位。古菌类群以乙酸利用型Methanosaeta、Methanosarcina为主, 说明甲烷形成过程以乙酸途径为主。中间代谢产物VFAs组成与不同产甲烷菌代谢功能分析的结果证明了古菌群落组成多样性与其代谢功能的对应关系。     

菠萝果实发育相关RFD1基因的克隆及表达

Blast菠萝果实不同发育时期的cDNA文库测序结果,并用信息生物学软件和相关网站进行拼接和分析,设计特异引物RT-PCR．得到一个2750bp、编码761个氨基酸的全长基因序列,命名NRFD1。预测该蛋白是一个亲水性、且具有多个磷酸化位点的分泌性蛋白,可能位于叶绿体中。半定量PCR分析发现RFD1基因表达量在果实发育期不断增加,70d达到最高：而在70d果实的不同部位并没有显著差异性,仅果实外部略有增高。     

拟南芥白化突变体心口的基因定位与分析

EMS30是拟南芥经甲基磺酸乙酯（EMS）诱变得到的白化突变体。该突变体的叶绿体结构存在严重缺陷,同时伴随叶绿素缺失。遗传分析显示EMS30突变体的突变表型受隐性单基因控制。采用图位克隆的方法对EMS30突变基因进行定位的结果显示,该基因位于拟南芥第一条染色体的分子标记F21M12和F14N23之间的96kb区间内,该区间包含25个基因。通过生物信息学分析发现,该区间内有3个基因定位在叶绿体或与叶绿体发育相关。这些结果有助于该基因的克隆,为阐释叶绿体发育提供线索。     

海南坡鹿CDC42 cDNA的克隆、原核表达及纯化

应用RT-PCR方法对海南坡鹿细胞分裂周期蛋白42(Cell division cycle 42,CDC42)编码区进行扩增,将扩增产物与PET-42a载体连接,重组质粒鉴定正确后,进行生物信息学分析;构建pET42a-hdCDc42表达载体,经IPTG诱导表达,将表达产物进行SDS-PAGE、可溶性分析、纯化及Wes...