蜕皮激素和有效霉素对粘虫几丁质合成酶B基因表达的影响

【目的】克隆粘虫Mythimnaseparata几丁质合成酶B基因的全长cDNA序列,研究该基因的时空表达特性,分析蜕皮激素(20-hydroxy ecdysone, 20 E)和有效霉素(Validamycin)对该基因表达水平的影响。【方法】本试验通过高通量测序法获得粘虫几丁质合成酶B基因的cDNA全长序列,利用RT-qPCR技术分析粘虫几丁质合成酶B基因在不同发育阶段和不同组织的特异性表达及蜕皮激素和有效霉素对其表达的影响。【结果】基因cDNA全长4 617 bp,包含一个完整开放阅读框,编码1个1 538个氨基酸组成的多肽,分子量为175.629 ku,理论等电点为5.96,包含17个跨膜螺旋,4个几丁质合成酶的标签序列CATMWHET,DGD,EDR和QRRRW及1个催化结构域。该基因命名为MsCHSB,GenBank登录号为KY348776。氨基酸序列比对表明,该基因与其他昆虫的几丁质合成酶B基因同源性高于52%,其中与蓓带夜蛾Mamestra configurata和棉铃虫Helicoverpa armigera的几丁质合成酶B基因同源性最高,分别为92%和83%。RT-qPCR技术表明粘虫在不同发育阶段和组织中均有mRNA的特异性表达,其中3龄第1天和中肠中MsCHSB基因相对表达量最高。注射10μg/μL浓度的蜕皮激素6 h和12 h后,表现为对该基因的诱导效应,与对照组差异显著;有效霉素处理后该基因相对表达量均被显著抑制,其中注射20μg/μL浓度的有效霉素48h后,抑制作用最为明显。【结论】本试验得到了一条新的粘虫几丁质合成酶B基因cDNA序列全长。蜕皮激素对MsCHSB基因的表达有一定的诱导作用,有效霉素对MsCHSB基因的表达有一定的抑制作用,该结果为进一步研究昆虫几丁质合成酶B打下了基础。     

Purification, Biological Activities, and Molecular Cloning of a Novel Mannose-Binding Lectin from Bulbs of Zephyranthes candida Herb （Amaryllidaceae）

A novel mannose-bindlng aggiutinln was purified from bulbs of Zephyranthes candida Herb by extraction, precipitation with 80% （NH4）2SO4, and ion-exchange chromatography on DEAE-Sepharose followed by gel flitration on Sephscryl S-100. The purified Z. candida agglutlnln （ZCA） migrated as a single band of 12 kDa on sodium dodecyi suifate-poiyecryiamide gel electrophoresis under reducing and non-reducing conditions. The apparent molecular mass of the iectln, as datermlned by gel filtration chromatography, was 48 kDa. The results Indicated that ZCA was composed of four Identical subunlts of 12 kDa each （homotetramerlc nature）. The ZCA agglutlhated rabbit erythrocytes, Escherichla coil and Saccharomyces cerevislae ceils at concentrations of 0.95, 1.90, and 31.30 μg/mL, respectively. Bloassays Indicated that ZCA has a significant effect on wheat aphid survival. Mortality after 7 d was 〉 90% at 0.26%. A degenerate primer was designed In accordance with the N-terminal partial sequence of purified ZCA. The full-length cDNA was cloned by 3＇- and 5＇-rapid amplification of cDNA ends. The full-length cDNA had 661 bp and the sequence encoded an open reading frame of 168 amino acids. The mature protein of ZCA Includes 109 amino acid residues and the molecular weight of the protein was 12.1 kDa. The result show that the zca gene encodes a protein precursor with a signal peptlde, a mature protein, and a C-terminal cleavage amino acids sequence. Molecular modeling of ZCA Indicated that Its three-dimensional atructure strongly resembies that of the snowdrop aggiutinin. Blocks＇ analysis revealed that the deduced amino acid sequence of ZCA has three functional domains specific for agglutination and three carbohydrate binding boxes （QDNY）.     

酿酒酵母CICC1747醛糖还原酶基因的克隆及表达

采用PCR技术以酿酒酵母CICC1747基因组DNA为模板扩增得到醛糖还原酶基因GRE3,插入到pET-15b载体的NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点之间,构建了酿酒酵母醛糖还原酶原核表达载体pET-15b-GRE3。将该载体转化到大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)中,重组菌株用IPTG诱导表达,采用紫外分光光度法测定醛糖还原酶活力,并对其表达条件进行初步优化。SDS-PAGE电泳结果显示在分子量约37 kD处有明显的特异性蛋白质条带。发酵液的比酶活最高为54.94 mU/mg,与酿酒酵母野生菌株相比提高了近10倍。     

单菌落PCR法直接快速鉴定重组克隆*

利用单菌落PCR法直接筛选含有GFP、LTB-ST外源基因的重组克隆,阳性克隆可以扩增出目的条带,和质粒PCR扩增的结果一致。同时,单菌落PCR法也可应用于重组质粒转化后的农杆菌的筛选,单菌落PCR法的扩增结果和农杆菌液扩增的结果一致。结果表明,单菌落PCR法是一个有效简便的鉴定重组阳性克隆的方法。     

盐地碱蓬液泡膜Ca2+/H+逆转运蛋白SsCAX1 N末端原核表达和多克隆抗体的制备

采用PCR技术,从盐地碱蓬液泡膜Ca2+/H+逆转运蛋白SsCAX1的cDNA中扩增了其N末端亲水区段(1～210 bp),并将其插入到原核表达载体pGEX-6p-3中进行诱导表达.获得分子量约33.5 kDa的可溶性融合蛋白,经纯化后从免疫家兔中得到了SsCAX1的特异性抗体.     

蚯蚓纤溶酶新基因EfP-0的电子克隆及其编码区序列RT-PCR验证

利用生物信息学手段,以期获得蚯蚓纤溶酶F-Ⅰ-0组分的基因。根据从粉正蚓（Lumbricus rubellus）中分离的FⅠ0组分的N端氨基酸序列VVGGSDTTIGQYPHQL,利用DNAMAN软件通过电子克隆方法,从Lumbricidae 的dbEST中获得该组分的核酸序列信息,设计特异引物, 经过RT-PCR,成功地从赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）中克隆到一条蚯蚓纤溶酶新基因,命名为EfP-0。EfP-0基因全长678bp, 编码225个氨基酸的成熟肽,属丝氨酸蛋白酶,胰蛋白酶家族,与F-Ⅰ-0组分的氨基酸组成非常接近。BLAST证明,EfP-0与已报道的蚯蚓纤溶酶基因之间的相似性均低于40％,因此为蚯蚓纤溶酶中的一个新基因,GenBank 登录号为DQ836917。构建的pMAL-c2x-EfP-0重组质粒,在大肠杆菌TB1中获得融合蛋白MBP-EfP-0的可溶性表达,表达产物有酪蛋白平板溶解活性。     

甘蔗ACC氧化酶全长cDNA的克隆及序列分析

ACC氧化酶是高等植物乙烯生物合成途径中的限速酶。根据报道的植物ACC氧化酶基因序列设计特异引物,从甘蔗cDNA文库中克隆到一ACC氧化酶基因片段,命名为GZ-ACO,该基因长792bp,与甘蔗基因组文库中克隆的ACO基因片段仅18个碱基之差。根据该cDNA片段序列,设计两对末端扩增的特异引物,利用RACE-PCR技术,获得GZ-ACO片段的5′端和3′端序列。用VectorNTI7.0软件对三个序列进行拼接和分析,结果得到全长的甘蔗GZ-ACO氧化酶基因。GZ-ACOcDNA核苷酸序列长1307bp,具有一个972bp完整的读码框,启动子ATG位于126bp,终止子TAA位于1097bp,推导编码323个氨基酸。系统进化分析表明,GZ-ACO基因氨基酸序列与其它植物已报道的ACC氧化酶基因具有65%~86%的同源率,且与单子叶禾本科植物首先聚类,其次与单子叶芭蕉科、兰科植物聚类,最后与双子叶植物聚类,与植物形态的系统进化结果一致。该基因已在DDBJ/EMBL/GenBank基因数据库注册,注册号为AY521566。     

人白细胞介素26的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

克隆人白细胞介素-26(human interleukin-26,hIL-26)基因,构建高效稳定的大肠杆菌表达菌株。对GenBank上报道的hIL-26基因进行序列分析后设计合成引物,利用RT-PCR技术从人外周血单个核细胞(PBMC)总RNA中反转录并扩增得到人成熟肽IL-26基因。将得到的基因克隆到pMD18-T载体中,菌落PCR筛选、酶切鉴定并进行DNA序列分析。用BamHI和EcoRⅠ将目的片段切下,插入表达载体pBV220相应的位点。42℃热诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的20%,Western印迹法证实重组蛋白为特异性蛋白,分子筛纯化后纯度达90%以上。表达的重组蛋白经谷胱甘肽复性缓冲液复性,用RT-PCR检测复性的重组蛋白能促进PBMC合成IFN-γ。     

异质性光照条件下匍匐茎草本野草莓的克隆整合

通过盆栽实验,研究了匍匐茎草本野草莓在异质性光照条件下的克隆整合。结果显示克隆整合显著增强了野草莓胁迫分株段的生长,损—益分析表明未受胁迫分株没有显著损耗,整个克隆片段的生长得到显著提高。在局部遮荫处理,克隆整合对克隆形态可塑性的修饰作用没有观察到。最后,讨论了克隆植物对环境的生态适应意义。