香蕉肉桂醇脱氢酶基因的克隆及表达分析

肉桂醇脱氢酶(CAD)在木质素合成过程中起关键作用。通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从香蕉根系cDNA均一化全长文库中获得一个肉桂醇脱氢酶基因,命名为MaCAD1(GenBank登录号为KF582533)。MaCAD1是香蕉MYB基因编码框全长cDNA,包含一个1 077bp的最大开放阅读框(ORF),编码358个氨基酸。蛋白质序列同源比对发现,其含有完整的醇脱氧酶的典型保守结构域,属于典型的CAD蛋白。系统进化树比对分析表明,MaCAD1与水稻OsCAD6(CAD39907)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明MaCAD1基因组成型表达于香蕉各个组织。在耐病和感病品种中,MaCAD1均上调表达,但在耐病品种中MaCAD1在所有时间点相对于对照增加的倍数均高于感病品种,表明MaCAD1基因在香蕉的抗病性中起着重要作用,MaCAD1可以作为一个新的响应枯萎病侵染的标记基因。     

新疆核桃WJ-CAD和ZJ-CAD基因克隆及时空表达表达分析

肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成中最后一步反应酶。本研究采用RT-PCR技术克隆露仁核桃WJ-CAD基因和硬壳完整核桃ZJ-CAD基因,研究CAD基因在硬壳完整和露仁核桃内果皮中发育过程中的表达特性。WJ-CAD基因cDNA序列含有788 bp ORF,编码258个氨基酸,分子量84.57 kD,理论等电点5.05;ZJ-CAD基因cDNA序列含有666 bp ORF,编码332个氨基酸,分子量81.93 kD,理论等电点5.09;对所编码的蛋白预测分析表明均属于FrmA超基因家族;实时荧光定量PCR结果表明,WJ-CAD基因的相对表达量整体呈现下降-上升-下降的趋势,ZJ-CAD基因的相对表达量整体均呈现上升-下降-上升-下降的趋势,2个基因均在花后65 d表达量达到最高峰,其后期表达量均较低,CAD基因在"温138"核桃内果皮中的表达量远低于同期"纸皮"的表达量。推测"温138"核桃露仁现象由于花后65 d后木质素合成量降低,导致缺乏木质素的积累或影响木质素单体的组成,从而造成内果皮发育不完整(露仁),初步证明CAD基因参与调控木质素合成,露仁现象可能由于硬核期缺乏木质素的积累。     

能源植物芒草C4H和CAD基因片段的克隆及分析

基于GenBank报道的近缘物种C4H和CAD基因cDNA序列,应用Primer Premier5.0软件设计2对PCR扩增引物。用CTAB-LiCl法提取芒草总RNA,经反转录后合成cDNA,应用RT-PCR方法成功扩增出MsC4H和MsCAD基因片段并克隆到pMD18-T载体。测序结果表明MsC4H和MsCAD基因片段长度分别为305bp和269bp,编码101个和51个氨基酸。Blast分析结果显示克隆序列与其它植物的C4H及CAD基因具高同源性。已将克隆的MsC4H和MsCAD基因cDNA序列提交至GenBank数据库,其注册号分别为JQ598686和JQ598683。     

苦荞谷胱甘肽转移酶(FtGST)基因的克隆与序列分析

采用RACE技术,从苦荞(Fagopyrum tatarium)中克隆得到一个谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferase protein,FtGST)基因。序列分析表明,FtGST基因全长DNA序列和cDNA序列编码区分别为746 bp和666 bp,DNA序列含有一个长度为80 bp(342-421 bp)的内含子;开放阅读框(ORF)长666 bp,编码221个氨基酸。生物信息学分析表明,FtGST基因推导的蛋白质含有Tau家族典型的底物结合口袋、谷胱甘肽结合位点(G-site)和疏水性底物结合位点(H-site)氨基酸残基,表明FtGST为Tau家族蛋白。     

苹果α-法尼烯合酶基因的启动子序列及同源基因

本文通过设计引物进行PCR扩增α-法尼烯合酶(AFS)基因的5'端区段并测序,获得510bp的‘国光’苹果AFS基因启动子和5'端非翻译区(5'UTR)序列,已在GenBank注册(登录号FJ263961)。序列分析结果表明,该序列具有典型的启动子特征,在转录起始点上游-46bp处有一个TATA盒,-93bp处有一个CAAT盒,-84bp处有一个W盒和-436bp处有一个热胁迫反应顺式作用元件GAAATTTTTT。与‘皇家嘎拉’苹果的AFS基因启动子序列(GenBank登录号AY786553.1)比对,本研究发现‘国光’苹果AFS基因启动子序列中有6个碱基(-186T,-207T,-283C,-301A,-413A和-433A)发生变异,‘皇家嘎拉’苹果AFS基因启动子序列相应位置的碱基分别为碱基缺失、-206C、-282G、-300G、-412G和-432G。重要的是,其中‘国光’苹果-413A碱基变异为G发生在一个热胁迫反应顺式作用元件GAAATTTTTT中,苹果虎皮病发生和AFS基因的转录表达是否受到这一碱基变异的影响值得进一步探讨。本研究结果还表明,在苹果AFS基因启动子和5'UTR序列中存在一个正向重复序列1(R9+IR18+R9),重复单元R9长度9bp,转录起始点位于其长度18bp的IR18区段。有趣的是,本研究新发现了一个与AFS基因启动子和5'UTR序列高度同源的450bp基因片段(GenBank注册登录号FJ469631),该同源片段缺失AFS基因中的27bp序列(R9+IR18,包含转录起始点)。据我们所知,这是果树中存在AFS基因启动子同源序列的首次报道。     

西瓜果实特异启动子WSP功能区域的初步定位

西瓜AGPase的大亚基基因wml1的 5′端上游 15 73bp序列 ,是一个果实特异性启动子 (命名为WSP)。根据WSP内部酶切位点 ,获得了 3个不同 5′端缺失的启动子片段 (长分别为 12 0 1bp、898bp、795bp) ,并构建成植物瞬间表达载体 ,与含WSP的瞬间表达载体一起用基因枪的方法转入西瓜叶、茎、花及不同发育期果实中。瞬时表达结果表明 ,15 73bp、12 0 1bp、898bp的片段均能指导GUS基因在西瓜果实和花中特异性表达 ,但是表达强度和表达时期有所不同 ,795bp的片段不能指导GUS基因表达。推测在 180bp 5 5 1bp之间可能存在促进外源基因在果实发育后期表达的顺式作用元件 ,而果实特异调控区域可能位于 85 4bp 95 7bp之间。     

柳紫闪蛱蝶线粒体基因组全序列及与相关蛱蝶类的比较分析(英文)

该文对柳紫闪蛱蝶Apaturailia(鳞翅目:蛱蝶科)的线粒体基因组全序列进行了测定,同时结合其它已知蛱蝶类的相应序列进行了比较分析。结果显示:柳紫闪蛱蝶的线粒体基因组(GenBankaccessionno.:JF437925)是一个15242bp的环状DNA分子,包含13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因和22个tRNA基因。13个蛋白编码基因中,除了COI基因的起始密码子是CGA外,其余12个蛋白编码基因都具有标准的ATN起始密码子;柳紫闪蛱蝶与其它已测的10种蛱蝶在基因定位和排列顺序方面几乎相同,只是在非编码序列上存在细微的差异,其核苷酸的构成及密码子使用频率都处于鳞翅目昆虫的范围之内。22个的tRNA基因中,除了tRNASer(AGN)缺少DHU臂,其余的tRNA基因都显示为典型的三叶草结构。基因组共存在9处基因间重叠区(总长度为33bp)以及12个基因间隔区(总长为155bp,最长间隔是49bp,最短的是1bp)。在ND6和Cytb间的间隔区中还发现有(TA)23似微卫星结构。与其他蛱蝶类相似,403bp的AT富集区包含有ATAGA,ATTTA二个保守模块(一个21bp的poly-T,一个10bp的poly-A),以及二个似微卫星的重复结构((TA)10和(TA)7)。     

盐穗木钾转运蛋白基因HcKUP12的克隆及在盐胁迫下的表达分析

利用RACE技术从盐生植物盐穗木(Halostachys caspica)中克隆获得了一个钾离子转运体基因,经BLAST同源比对发现该基因与拟南芥钾离子转运蛋白At KUP12基因最为相似,命名为Hc KUP12。Hc KUP12基因c DNA全长为2953 bp,含有2544 bp的阅读框、262 bp的5'-UTR和147 bp的3'-UTR,编码847个氨基酸,分子质量为93.31 k D,理论等电点为7.19。利用实时荧光定量RT-PCR分析了Hc KUP12基因在600 mmol/L Na Cl处理下胁迫24 h的表达模式,结果显示该基因在盐胁迫下表达量显著增加,至处理24 h时达到最高(为对照的225倍),初步推测其可能是与盐穗木耐盐相关的一个候选基因。     

棉花生长素应答因子克隆和序列分析

通过电子克隆和RACE相结合的方法,从陆地棉中克隆到一个新ARF基因。序列分析表明,该基因序列全长为2393其中包括87bp的5′非编码区(5′UTR),1941bp的蛋白质编码区,终止密码子TAA和362bp的3′非编码区。该基因可编码647个氨基酸的蛋白质,分子量为71.9kD,等电点(PI)为8.2。该基因含有一个与拟南芥中ARF基因相似的B3结构域和一个Auxin_resp结合位点,表明该基因与拟南芥ARF基因有很高的同源性,推测具有相似或相同的功能。     

斐豹蛱蝶线粒体基因组全序列的测定和分析(英文)

该研究对斐豹蛱蝶(Argyreus hyperbius)(鳞翅目:蛱蝶科)线粒体基因组全序列进行了测定和初步分析。结果表明:斐豹蛱蝶线粒体基因全序列全长为15156bp,包含13个蛋白质编码基因、22个tRNA和2个rRNA基因以及1个非编码的A+T富集区,基因排列顺序与其它鳞翅目种类一致;线粒体全序列核苷酸组成和密码子使用显示出明显的A+T偏好(80.8%)和轻微的AT偏移(AT skew,?0.019)。基因组中共存在11个2～52bp不等的基因间隔区,总长96bp;以及14个1～8bp不等的基因重叠区,总长34bp。除COI以CGA作为起始密码子外,13个蛋白质编码基因中的其余12个基因是以ATN作为起始密码子。除COI和COII基因是以单独的一个T为终止密码子,其余11个蛋白质编码基因都是以TAA结尾的。除了缺少DHU臂的tRNASer(AGN),其余的tRNA基因都显示典型的三叶草结构。tRNA(AGN)和ND1之间的基因间隔区包含一个ATACTAA结构域,这个结构域在鳞翅目中是保守的。A+T富集区没有较大的多拷贝重复序列,但是包含一些微小重复结构:ATAGA结构域下游的20bp poly-T结构,ATTTA结构域后的(AT)9重复,以及位于tRNAMet上游的5bp poly-A结构等。这项研究所揭示的斐豹蛱蝶的线粒体基因组特征,不仅为认识蛱蝶科的遗传多样性贡献数据,而且对于该物种的保护生物学、群体遗传学、谱系地理及演化研究等具有重要意义。     

丹参肉桂醇脱氢酶基因（SmCAD）的克隆及表达分析

肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD）依赖于NADPH还原肉桂醛及其衍生物,是催化木质素单体生物合成途径的最后一步关键酶。通过分析丹参转录组数据库,从丹参中获得一条肉桂醇脱氢酶基因,命名为SmCAD（Genebank注册号：HQ162287）。该序列包含一个长为1083 bp的开放阅读框,有3个内含子和4个外显子,编码360个氨基酸,含有NADP（H）结合域,Zn1和Zn2锌结合位点。利用BD walking的方法获得其启动子序列1202 bp,序列分析结果表明,SmCAD启动子区包含茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA3）响应元件以及MYB结合位点。利用实时荧光定量PCR分析表明,该基因在丹参根、茎、叶中均有表达,且其表达受到MeJA的诱导和GA3的抑制,推测该基因可能参与了丹参对外源信号的应答反应。研究结果可为进一步研究SmCAD基因在丹参中的具体功能提供理论依据。     

粘虫核糖体蛋白S7cDNA的克隆和表达分析

运用RT—PCR和RACE技术克隆了粘虫Mythimnaseparata（Walker）核糖体蛋白s7基因（RPS7）的全长eDNA序列（GenBank登录号：JN582331）,并对其进行生物信息学分析。结果表明,粘虫RPS7全长eDNA序列为762bp,包括5’非编码区32bp和3’非编码区67bp。其开放阅读框（573bp）编码190氨基酸肽链,具有核糖蛋白S7e蛋白家族典型特征。该肽链理论分子量为21．924ku,等电点为9．82,富含4种类型的特定功能位点。该蛋白序列与其他动物RPS蛋白序列具有96．8％-98．2％高度同源性。应用荧光实时定量技术建立了粘虫脑部胚后发育RPS7表达模式。RPS7表达量随胚后发育脑部重建呈现出动态变化,这一结果显示RPS7是在转录水平上呈现发育性调节。     

粘虫β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

β-actin基因作为actin家族的一员,在基因定量实验中常用作内参基因。本实验运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫Mythimna separata(Walker)cDNA为模板,对β-actin基因进行克隆获得全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对β-actin基因全长cDNA序列及推测得到的β-actin蛋白序列进行分析。结果表明,获得的粘虫核β-actin基因cDNA序列长度为1 472 bp,其中包括68 bp的5′非编码区、273 bp的3′非编码区和1 131 bp的开放阅读框,编码一个376个氨基酸蛋白,具有actin蛋白家族典型特征。推测得到的粘虫β-actin蛋白理论分子量为41.7497 ku,等电点为5.29,富含6种类型的特定功能位点。该蛋白序列与其他动物β-actin蛋白序列具有97.9%～99.7%高度同源性。β-actin表达量检测结果显示β-actin在6种不同组织间表达无显著差异(P>0.05),表明β-actin可作为研究粘虫不同基因表达水平高低的可靠内参基因。该基因的cDNA序列已经递交GenBank并获得登录号为GQ856238。     

Cloning, expression, site-directed mutagenesis and immunolocalization of phenylalanine ammonia-lyase in Bambusa oldhamii

Phenylalanine ammonia-lyase (PAL, EC 4.3.1.5) from green bamboo was isolated and cloned from the shell of Bambusa oldhamii. The K(m) of bamboo shell PAL for L-Phe was 476 μM, and the molecular mass of native PAL was estimated as 275 kDa and the molecular mass of a subunit was about 76 kDa, indicating that PAL from bamboo also exists as a tetramer. The optimum temperature for PAL activity was 50°C and the optimal pH 9.0. The identity of the purified bamboo shell PAL was confirmed using Q-TOF tandem MS/MS de novo sequencing. Four PAL genes, designated as BoPAL1 to BoPAL4, were cloned from B. oldhamii. The open reading frames of BoPAL3 and BoPAL4 were 2142 and 2106 bp in size, respectively: BoPAL2-4 contained one intron and two exons, but no intron was found in BoPAL1. BoPAL4 expressed in Escherichia coli possessed both PAL and tyrosine ammonia-lyase activities. While recombinant wild-type PAL proteins had similar biochemical properties to the native bamboo shell PAL, both site-directed mutagenesis of BoPAL1 F133H and BoPAL2 F134H, respectively, showed decreased k(cat)/K(m) values toward L-Phe, whereas BoPAL2 F134H showed a slightly increased k(cat)/K(m) value toward L-Tyr. These data suggest other residues largely control Phe/Tyr substrate specificity. An antibody raised against the purified shell PAL was generated for histochemical studies. In bamboo shell and branch shoots, PAL was localized primarily in sclerenchyma cells.     

甘菊BADH基因cDNA的克隆及在盐胁迫下的表达

利用PCR、RT—PCR和PCR—RACE技术,从菊科植物甘菊（Dendranthema lavandulifolium）中克隆到2个甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase,BADH）基因的同源基因,分别命名为DlBADH1和DlBADH2,GenBank登录号分别为DQ011151和DQ011152。DlBADH1的cDNA全长1821bp,其开放阅读框编码503个氨基酸的蛋白质;DlBADH2全长1918bp,编码506个氨基酸的蛋白质。两个基因核苷酸序列的同源性为97％,推导的氨基酸序列的同源性为98％。与已发表的其它植物BADH基因氨基酸序列的同源性在64％以上。在推导的氨基酸序列中,均含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽（VTLELGGKSP）以及与酶功能有关的半胱氨酸残基（C）。在推导的氨基酸序列的系统关系中,甘菊位于其它双子叶植物和单子叶植物之间,与其植物分类的系统关系相吻合。RT—PCR—Southern半定量表达分析表明,甘菊BADH基因家族中存在表达受盐诱导的成员。     

慈竹C3H基因克隆及其生物信息学分析

香豆酸-3-羟化酶(C3H)是调控植物木质素生物合成的关键酶,本文以慈竹为材料,利用RT-PCR技术克隆慈竹C3H基因,并对其进行生物信息学分析,为通过基因工程手段降低工业用竹木质素含量奠定基础。结果表明,该cDNA序列全长为1 581 bp,编码区为1 539 bp,编码512个氨基酸,蛋白分子量为58.33KD,等电点为9.09;氨基酸序列和结构分析显示C3H有一个保守区域,即P450结构域。系统进化分析表明,该基因与毛竹和水稻的C3H基因具有很高的同源性。慈竹与毛竹和水稻C3H基因编码蛋白为亲水性蛋白,这三种编码蛋白很可能定位在内质网(膜)上,其编码蛋白的二级结构及三级结构都含有丰富的α-螺旋和无规卷曲,β-转角和延伸链的含量较少,都含有2个相对保守的无序化区域。该基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为JF693629,可能与慈竹木质素的生物合成有关。     

基于转录组测序的慈竹笋木质素基因筛选及其表达分析

慈竹（Bambusa emeiensis）纤维素含量丰富,是较好的造纸原料,但竹茎中木质素影响着制浆生产及纸浆质量。目前,对慈竹木质素生物合成机制所知甚少,这限制了遗传调控竹木质素的研究。本文以拟南芥、水稻等植物的已知木质素基因作为查询序列,通过BLASTp和系统进化分析,从10、50、100和150 cm慈竹笋转录组数据中筛选到351个木质素生物合成相关Unigenes,包括51个LAC,37个4CL、26个PAL、34个CCR和25个CAD相关转录子,其数量高于其他已报道的竹类植物。转录丰度和定量基因表达分析发现16个木质素基因,包括2个PAL、5个CCR、3个4CL、2个CADH2和4个LAC,随着笋发育而表达上调,表明其可能与发育性木质素积累相关。     

甘薯质体中的乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accD的克隆与序列分析

依据烟草质体全基因组序列设计引物,以甘薯质体基因组DNA为模板,PCR扩增包含质体accD基因完整编码区在内的一段序列（GenBank登录号为GQ395771）。序列分析表明：该片段全长为2209bp,包括1548bp的nccD基因编码序列,推测编码515个氨基酸的蛋白质,该蛋白序列具有异质型β-CT中保守的锌指结构和C末端5个基元。同时绘制了该DNA片段的限制性酶切图谱。相似性比较显示,甘薯accD基因与大豆、马铃薯、拟南芥、人参、莴苣、葡萄、海岛棉、甘蓝、辣椒、菠菜、番茄和烟草的accD基因核苷酸相似性为72％-87％,氨基酸相似性为58％-83％。     

球孢白僵菌tps2基因的克隆和生物信息学分析

运用SMART RACE RT-PCR技术与DNA步移技术,首次从球孢白僵菌中克隆出完整的海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶TPS2的基因编码区序列及上游序列。该基因cDNA全长3219 bp,其中开放阅读框（ORF）2619 bp,编码872个氨基酸。成熟蛋白理论分子量为97.8 kD,理论等电点为6.32。编码框结构基因的全长为2821 bp,有两个长度分别为140 bp和62 bp的内含子。分析表明,上游序列中含有TATA-box、CAAT-box和GC-box,并且也存在GATA元件等启动子顺式调控元件。本文结果将为进一步研究海藻糖在虫生真菌中的生理合成以及抗逆调控机制奠定坚实的基础。