乙型脑炎病毒SA14—14—2株E蛋白主要抗原片段的高效表达

在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,将其亚克隆入酵母表达载体pPICZα-A,以电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物.由于糖基化不同,所表达产物有两种,其相对分子质量分别为44kDa和50kDa,表达量较高,约为290mg/L,经Western印迹验证,有较好的抗原性.在ELISA试验中,我们直接以PBS透析后的酵母上清包被,能够很明显地区分出乙脑阴阳性血清,与RT-PCR检测的相符率达95%,为制备JEV的诊断抗原和基因工程疫苗提供了依据.     

丙型肝炎病毒结构蛋白E1在昆虫细胞中的表达及定位

本文在大肠杆菌中表达了与GST融合无跨膜区的丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)E1蛋白,并通过免疫兔制备了兔抗E1的抗血清。然后利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了含有HCV结构蛋白E1基因的重组杆状病毒vAcHCVE1。通过Western blot分析,E1蛋白在Sf9细胞中表达分子量大小为30kDa大于预测的20kDa,表明存在翻译后修饰如糖基化等。通过Confocal显微镜观察当感染48h后E1蛋白定位在细胞质和细胞膜上。     

SARS病毒s1基因片段真核表达载体的构建及免疫效果

本研究根据GenBank登录的BJ01株SARS-CoV序列合成801bpS1基因片段,该片段被亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )得到重组质粒pcDNA3.1( )/S1;转染Hela细胞,SDS-PAGE、Western-Blotting鉴定蛋白表达;肌注免疫BALB/c小鼠,利用ELISA法检测免疫后小鼠的抗SARS-CoVIgG及IFN-γ水平,MTT法检测T细胞增殖活性。结果显示,重组质粒pcDNA3.1( )/S1可在Hela细胞内表达S1蛋白,免疫后小鼠的T细胞增殖活性增强,抗SARS-CoVIgG与IFN-γ水平升高。本实验说明pcDNA3.1( )/S1可诱导小鼠产生一定的体液免疫和细胞免疫应答。     

丁型肝炎病毒抗原的表达纯化和抗原性分析

丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus, HDV)是一种缺陷负链RNA病毒,其表面被乙肝病毒抗原(HBsAg)所包裹,内为丁型肝炎抗原(HDAg)及其基因组RNA。HDV基因组中有多个开放读码框架(ORF),其中只有抗基因组RNA链上的一个ORF编码的蛋白与HDAg相关[1,2]。HDV的抗原、抗体的测定是HDV感染诊断的主要标志,为了改进和提高HDV ELISA诊断试剂的质量,制备高纯度和高效价的HDAg尤为重要。为此,我们构建了HDAg基因表达株,以pQE表达系统为载体,利用该载体本身具备的6个组氨酸序列结构(6×histag)来纯化蛋白,直接提取高度纯化的HDAg,并应…     

人抑癌基因PTEN的原核表达载体的构建及融合表达

为研究抑癌因子PTEN蛋白的抑癌机理,掏建了PTEN cDNA的原核表达载体并进行融合表达。将含有PTEN cDNA的质粒pMD-PTEN经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切,回收PTEN基因片段与经相同酶切的高效原核表达载体pET-44a连接,经序列测定,证实融合型表达载体pET-Nus-PTEN构建成功。转化表达宿主BL21(DE3)后,IPTG诱导表达。经12％SDS-PAGE凝胶电泳,获得118kD的特异蛋白条带。目的蛋白占细菌总蛋白的17％。结果表明：PTEN基因和Nus基因融合表达成功,获得可溶性Nus-PTEN蛋白。该研究为PTEN蛋白的抑癌机理和基因工程药物的研究打下了基础,这是国内PTEN蛋白在原核细胞中成功表达的首次报道。     

肿瘤抑素抗肿瘤相关肽的克隆及生物活性

为得到肿瘤抑素中具有直接抗肿瘤活性肽并检测其生物学活性,人工合成肿瘤抑素中185～2 0 3位氨基酸(19肽)所对应的核苷酸序列,将其连接到融合蛋白表达载体pTYB2中,酶切和测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL 2 1(DE3)中诱导表达.表达的融合蛋白经几丁质亲和层析、二硫苏糖醇(DTT)的柱内还原,直接获得可溶性19肽.利用MTT法,细胞生长曲线,小鼠H2 2腹水型转移型肝癌实体瘤模型抑瘤实验并结合组织病理学切片,研究19肽的生物学活性.获得的19肽对B16小鼠黑色素瘤细胞、人SMMC 772 1肝癌细胞、人脐静脉内皮细胞的生长均具有抑制作用.小鼠H2 2腹水型肝癌抑瘤率达4 8 4 6 % .病理学切片显示,19肽可促使小鼠肿瘤组织坏死,血管数量减少.19肽具有较强的直接抗肿瘤活性,有可能成为肿瘤治疗的一种新的有前景的药物.     

杆状病毒表达系统研究进展

介绍了杆状病毒表达系统的构建策略,载体发展情况及其表达外源基因的影响因素.杆状病毒表达系统在基因工程、药物开发、疫苗生产等方面发挥了越来越重要的作用,其表达效率高,表达产物与天然产物有相似的结构和活性,且对人畜无害,为当今基因工程研究中最有发展前途的表达系统.     

IL-1023-57-PE40可溶表达、纯化及其细胞活性

以IL-10的功能短肽(35肽,即IL10第23至57氨基酸残基)为导向部分与PE40(绿脓杆菌外毒素除去受体结合区后的剩余部分)融合分别置入pet20b( )和pet28a( )构建重组毒素IL102357PE40的两种表达质粒,其中置于pet20b( )的重组毒素在BL21(DE3)pLysS中以周质分泌可溶形式表达,置于pet28a( )的重组毒素在Rosettablue(DE3)中以高效胞质可溶形式表达;依次通过硫酸铵盐析、疏水层析、阴离子交换层析、铜离子亲和层析纯化周质分泌成份,得90%重组毒素纯品;细胞活性实验表明,该重组毒素只对单核巨噬细胞有杀伤作用;细胞ELISA显示,该重组毒素对单核巨噬细胞的杀伤作用(IC50为13.9pmolL)符合绿脓杆菌外毒素的作用机理.     

静脉注射41BBLGFP融合表达质粒体内表达及其生物学活性

通过RTPCR方法扩增小鼠41BBLcDNA,以pEGFPN1为载体,构建融合蛋白41BBLGFP重组表达质粒p41BBLGFP.采用基于流体力学原理建立的裸DNA体内转染技术,从小鼠尾静脉快速(15s)注射质粒p41BBLGFP进行体内转染.荧光显微镜观察组织切片,见小鼠肝、脾、肾及肺中均有报告基因GFP表达,尤以肝细胞中荧光最强.进一步用Western印迹和免疫组织化学染色法确定肝细胞表面表达41BBL,用Hsp70H22细胞抗原肽皮下免疫小鼠,同时尾静脉注射质粒p41BBLGFP,检测血清中IL2和IFNγ的分泌.结果显示,质粒注射联合免疫组小鼠血清IL2和IFNγ的浓度分别较生理盐水对照组增加了3倍和4倍;脾细胞对H22细胞的杀伤率则由单独免疫组的45.74%±3.27%增至86.74%±9.36%.结果表明,体内(主要在肝脏)转染质粒p41BBLGFP可以成功表达,表达产物具有41BBL的生物学活性,为进一步研究体内转染41BBL用于基因治疗奠定了基础.     

人骨保护素N端片段在大肠杆菌中的表达及其活性分析

骨保护素 (OPG)成熟肽N端D1～D4结构域仅由 2个外显子编码 .以人基因组DNA作为模板 ,采用重叠延伸PCR得到N端D1～D4域编码序列 ,并在其上游引入 2×His密码子序列 ,然后克隆入载体pQE 30进行表达 ,SDS PAGE表明 8×His融合蛋白主要以包涵体形式存在 ,可被抗OPG抗体识别 .变性条件下通过Ni NTA金属螯合亲和层析对表达产物进行纯化后再经梯度透析进行复性 ,采用破骨细胞样细胞 (osteoclast likecell ,OLC)诱导分化实验来检测重组蛋白的生物活性 ,证实单核 巨噬细胞集落刺激因子 (M CSF)和破骨细胞分化因子 (ODF)可协同促进多核OLC的生成 ,但加入重组OPG片段后 ,OLC生成显著减少 .