HBV preS/S基因克隆及其在酿酒酵母中的表达

目的:探索利用酿酒酵母系统表达乙型肝炎病毒(HBV)preS／S基因。方法:利用PCR技 术,以HBV病毒DNA为模板,体外扩增HBV preS／S基因。然后构建重组表达载体pESC-preS／S。 用LiAc法转化酿酒酵母YPH50,选取重组菌进行培养,并诱导表达外源蛋白。提取蛋白浓缩后 进行SDS-PAGE分析,并经Western blot分析鉴定。结果:实验结果表明重组菌能够表达HBV preS／S蛋白。结论:利用酿酒酵母系统可成功表达HBV preS／S基因,为制备新型预防性疫苗提供 条件。     

大麦β-1,3-葡聚糖酶基因(GⅢ)启动子在转基因水稻中的诱导表达

将大麦β-1,3-葡聚糖酶同功酶基因(GⅢ)启动子(PGⅢ)与其报告基因gus(β-葡聚糖酸醛苷酶基因)耦联,构建植物表达载体,通过农杆菌介导法转化水稻.PCR、DNA印迹法结果显示,构建的pGⅢ-gus表达载体已整合到水稻基因组DNA中.GUS组织化学染色、RNA印迹法及荧光法结果显示,该启动子驱动的gus在水稻叶片中为低水平表达;而用水扬酸(SA)与稻瘟菌来源的激发子处理,可诱导gus的高水平表达.T1代种子的GUS组织化学染色结果也表明,SA与激发子可以诱导高水平的PGⅢ活性.这些结果表明PGⅢ是一种强诱导型启动子,并可能是一种病原菌诱导型的启动子.     

黑曲霉pepD基因阻断突变菌株的构建及功能分析

运用同源重组技术破坏了黑曲霉基因组中的pepD基因,该基因编码一种类subtilisin的胞外蛋白酶PEPD。实验以黑曲霉GICC2773基因组DNA为模板,PCR扩增pepD基因,并在此基因中间插入潮霉素抗性基因(hph)表达单元,由此产生了3.7kb的pepD阻断基因片段。将此阻断基因片段与载体pBS连接,构建成pepD基因阻断质粒pBSDH。采用原生质体-CaCl₂/PEG法将酶切阻断质粒得到的含pepD基因和hph表达单元的3.7kb线性片段转化AspergillusnigerGICC2773菌株,在含潮霉素的平板上筛选潮霉素抗性转化子,从这些抗性转化子中经PCR检测分离到到1个pepD基因阻断突变菌株?pepD66。外源漆酶分泌活性分析显示,黑曲霉pepD基因的破坏使其外源漆酶的分泌表达有所提高。     

序列比对程序Blat在转录组数据分析中的应用

随着功能基因组学研究领域的快速发展,人们已经开始系统地研究全基因组的转录以及全部基因发挥功能的动态机制。为实现此目标,需要从海量的转录组数据中提炼出能够揭示基因功能以及表达调控的重要信息。采用高性能的序列比对程序以满足规模化的比对需求是其中的瓶颈环节。通过综合比较目前流行的各种序列比对软件的性能,并针对不同的转录组数据分析任务对Blat进行详细的应用分析,结果发现,Blat能够解决转录组数据分析过程中的序列比对这一瓶颈,可广泛应用于功能基因组相关的数据分析任务。     

Antiporter Gene from Hordum brevisubulatum （Trin.） Link and Its Overexpression in Transgenic Tobaccos

A vacuolar Na^ /H^ antiporter cDNA gene was successfully isolated fromHordeum brevisubulatum (Trin.) Link using the rapid amplification ofcDNA ends (RACE) method. The gene was named HbNHXI and was found to consist of 1 916 bp encoding a predicted polypeptide of 540 amino acids with a conserved amiloride-binding domain. Phylogenetic tree analysis of the Na^ /H^ antiporters showed that the HbNHXI gene shares 55.3%-74.8% similarity with the vacuolar-type Na^ /H^ antiporters. Transgenic tobaccos that contain the HbNHXI gene, integrated by forward insertion into the tobacco genome, were obtained via Agrobacterium tumerfaciens and characterized for the determination of the concentration of Na^ and K^ ions, as well as proline, in the presence of 300 mmol/L NaCl. The T1 transgenic plants showed more tolerance to salt and drought than did wild-type plants. Our data suggest that overexpression of the HbNHXI gene could improve the tolerance of transgenic tobaccos to salt and drought through the function of the vacuolar Na^ /H^ antiporter.     

Ectopic Expression of the Pttknl Gene Induces Alterations in the Morphology of the Leaves and Flowers in Petunia hybrida Vilm.

A novel knottedl-like homeobox （knox） gene, Pttknl （Populus tremulaxtremuloides knottedl）, isolated from the cambial region of hybrid aspen, was introduced into Petunia hybrida Vilm. using the leafdisc method mediated by Agrobacterium. A series of novel phenotypes was observed in transgenic petunia plants, including the formation of ectopic spikes on the adaxial surface of corollas and small petals on the abaxial surface of corollas, fusion of floral organs, shortening of corolla midribs, the formation of tumor-like knots along the midrib on the abaxial surface and serrated lobs of corolla margins, and alterations in petal color; except for changes in the leaves and plant architecture, RT-PCR showed that the Pttknl gene was expressed in the leaves of different petunia transgenic plants, whereas no signal was detected in wild-type plants. The possible function of Pttknl in leaf and flower development is discussed.     

鲤鱼中Sox9b基因的克隆和表达

Sox9基因是一个重要的转录调控因子,参与性别决定及软骨等多种组织和器官的发育过程。本研究利用简并引物扩增鲤鱼基因组DNA,首次发现在鲤鱼中存在两种形式的Sox9基因。二者在保守盒区编码的氨基酸序列相同,并都存在一个内含子,但内含子序列差异很大,分别长704bp和616bp。在此基础上采用RACE技术克隆了鲤鱼Sox9b基因的5’端和3’端,通过拼接获得了2447bp 的全长cDNA序列,编码428个氨基酸。其中96-174位共79个氨基酸为HMG保守盒。将鲤鱼Sox9b基因与三刺鱼等九种动物的氨基酸序列相比较发现,它们的同源性高达75%以上,显示Sox9 基因在进化中较保守。应用半定量RT-PCR技术对成体鲤鱼不同组织中Sox9b基因的表达进行了分析,结果表明该基因广泛表达,尤以脑及精巢中表达最为丰富。     

小麦TaMlo基因的原核表达、抗体制备及细胞化学分析(简报)

白粉病菌(Blumeria graminis)是一类高度专化性的寄生真菌,可侵染650多种单子叶植物和 9000多种双子叶植物,能够引起多种麦类作物的白粉病,给农业生产带来巨大的损失。由于白粉病菌生理小种多、变异快,所以利用专化性抗病基因难以解决植物的持久抗病性问题。人们在研究大麦白粉病时．发现大麦Mlo基因的隐性突变可导致大麦对绝大多数白粉病菌生理小种的高效持久的广谱抗病性。Schulze-Lefert等多家实验室合作于1997年成功克隆了野生的 Mlo基因。进一步研究表明．该基因编码一种植物特有的具有7个跨膜区和羧基端长尾的膜蛋白(Mlo),它可能对植物细胞的坏死起负调控作用。但Mlo基因如何表达及其在白粉病菌发育中的作用机制尚不清楚。     

δ差异显示筛选武定乌骨鸡"乌色"性状相关基因

“乌色”是乌骨鸡的一个主要性状,乌骨鸡的经济价值与药用价值关键在于乌骨鸡的“乌色”性状。为筛选与乌骨鸡“乌色”性状可能相关的基因,应用δ差异显示方法,系统比较全同胞武定乌骨鸡与非乌骨鸡的基因表达情况,回收、再扩增与纯化差异片段,并通过Northern blot验证、克隆和测序后,获得29个ESTs。序列分析结果表明,有8个ESTs分别与鸡已知基因骨骼肌-β原肌球蛋白基因(A17)、贲门肌球蛋白碱轻链基因(B57)、插入激活ras致癌基因(A36)、fra-2致癌基因(B36)、16S rRNA基因(A35)及线粒体基因组序列(D36、C39和D9)同源,序列相似性分别为97％、100％、98％、98％、98％、99％、99％和97％。5个ESTs分别与其他生物已知基因同源,它们是人TTN基因转录本变异novex-2(B53)、人磷酸葡糖变位酶5基因(B109)、人信号识别物54kD基因(B20)、人与鼠核糖核酸酶／血管形成抑制因子基因(C26、D31),差异片段与它们的序列相似性分别为82％、82％、87％、99％和99％,这些基因在鸡中还没被克隆。13个ESTs属于新基因片段,其中9个与数据库中ESTs序列相似性较高,4个属于全新基因片段,在数据库中没有与它们序列相似性较高的ESTs。选择16条差异片段,根据测序结果设计特异性引物,利用12个随机采集的武定乌骨鸡或非乌骨鸡样本,进行基因表达分析,结果表明,1个新基因(A7)片段、2个已知基因(插入激活ras致癌基因A36、信号识别物54kD基因B20)片段具有乌骨鸡或非乌骨鸡表达特异性,从而初步确定它们与武定乌骨鸡“乌色”性状相关。     

Ad5-knob蛋白在大肠杆菌中可溶性表达及其活性检测

采用PCR技术, 从AdEasy-1质粒DNA中获得knob全长序列, 克隆入pGEM-T vector中.DNA测序鉴定后, 构建pQE-30/knob重组表达载体, 转化大肠杆菌M15 pREP4),IPTG诱导表达腺病毒5型纤维蛋白的knob功能域(Ad5-knob), SDS-PAGE分析,表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在于细菌裂解液上清之中.经Ni2+-NTA亲和层析一步分离纯化后,洗脱产物中Ad5-knob蛋白纯度超过95%.N-端氨基酸测序证实了纯化产物为Ad5-knob蛋白,细胞受体结合实验检测到所得蛋白能够与Hela细胞上的相应受体特异性结合.上述结果表明在大肠杆菌中已经高效表达了可溶性Ad5-knob蛋白,一步即纯化该蛋白,并具有良好的生物活性,为其下阶段的深入研究提供了重要的实验材料.