采用sPD-1协同4-1BBL进行肿瘤免疫基因治疗的研究

目的 探讨采用sPD-1协同4-1 BBL进行肿瘤免疫基因治疗的效果及相关的免疫学机制.方法 以不同剂量的H22肝癌细胞接种于BALB/c小鼠右后腿肌肉内,建立小鼠肿瘤模型;采用可溶性PD-1 （sPD-1）和4-1 BBL真核表达质粒体内转染进行基因治疗;观察接种不同剂量肿瘤细胞、不同治疗时间小鼠的成瘤率及肿瘤治疗效果;RT-PCR检测肿瘤微环境中免疫调控相关基因的表达;组织切片检测肿瘤细胞浸润肌肉组织的组织学变化;流式细胞仪检测脾脏细胞毒性T细胞（CTLs）的杀瘤效率.结果 转染4-1 BBL/sPD-1基因治疗后,接种低剂量（1 × 104个/ml） H22肿瘤细胞的小鼠肿瘤生长完全受到抑制;接种高剂量（1×105个/ml） H22肿瘤细胞的小鼠肿瘤也受到显著抑制.通过延长基因治疗,荷瘤小鼠的成瘤率随着治疗时间的延长逐渐递减,至8周时成瘤率为0;基因治疗不仅促进IFN-γ和IL-2基因表达上调,而且也使TGF-p、IL-10的表达下调;瘤组织中CD8＋ T淋巴细胞数量增多和脾淋巴细胞的杀瘤效率显著增加.结论 利用体内存在的少量肿瘤可作为抗原刺激淋巴细胞的激活;基因治疗适用于对手术、化疗、放疗后体内残存的少量肿瘤细胞的清除;当体内存在大量肿瘤细胞时,适当延长基因治疗时间可获得较好的治疗效果.     

重组FN多肽CH50抑制黑色素瘤B16细胞体内转移的研究

目的研究重组纤黏连蛋白（FN）多肽CH50对小鼠黑色素瘤B16细胞体内转移的影响,以探讨CH50多肽抑制肿瘤转移的可能分子机制。方法体外培养黑色素瘤B16细胞,用荧光染料CFSE标记,接种脾脏后24h取脾、肝、肺做冰冻切片,观察肿瘤细胞在3种组织中的侵袭情况。从脾脏接种B16细胞,建立体内肿瘤转移动物模型,采用基于流体动力学的体内基因转染方法于小鼠体内表达CH50多肽,RT-PCR检测CH50mRNA在肝组织的表达,Western印迹检测CH50多肽的表达。通过比较原位肿瘤结节及转移结节在数量、大小、分布上的差异及检测原位肿瘤组织中MMP-2、MMP-9表达差异,观察CH50多肽的治疗效果。结果注射24h后即可在脾脏形成荧光结节。pCH510质粒通过尾静脉注射后,可在肝组织中检测到CH50mRNA及CH50多肽的表达。从脾脏接种B16细胞后第14天可在脾脏形成原发肿瘤,至第35天肝脏表面已形成转移瘤结节,成功建立了体内器官问（脾转肝）肿瘤转移动物模型。体内转染表达CH50多肽能抑制肿瘤生长、侵袭和转移,抑制原位肿瘤结节中MMP-2、MMP-9的表达。结论CH50多肽可以通过对MMP-2、MMP-9蛋白表达的抑制作用来抑制黑色素瘤B16细胞的成瘤能力和体内侵袭、转移能力。     

静脉注射41BBLGFP融合表达质粒体内表达及其生物学活性

通过RTPCR方法扩增小鼠41BBLcDNA,以pEGFPN1为载体,构建融合蛋白41BBLGFP重组表达质粒p41BBLGFP.采用基于流体力学原理建立的裸DNA体内转染技术,从小鼠尾静脉快速(15s)注射质粒p41BBLGFP进行体内转染.荧光显微镜观察组织切片,见小鼠肝、脾、肾及肺中均有报告基因GFP表达,尤以肝细胞中荧光最强.进一步用Western印迹和免疫组织化学染色法确定肝细胞表面表达41BBL,用Hsp70H22细胞抗原肽皮下免疫小鼠,同时尾静脉注射质粒p41BBLGFP,检测血清中IL2和IFNγ的分泌.结果显示,质粒注射联合免疫组小鼠血清IL2和IFNγ的浓度分别较生理盐水对照组增加了3倍和4倍;脾细胞对H22细胞的杀伤率则由单独免疫组的45.74%±3.27%增至86.74%±9.36%.结果表明,体内(主要在肝脏)转染质粒p41BBLGFP可以成功表达,表达产物具有41BBL的生物学活性,为进一步研究体内转染41BBL用于基因治疗奠定了基础.     

CH50真核表达载体pCH503的构建及小鼠体内表达的趋化与抗肿瘤活行

构建重组FN多肽CH50真核表达载体并在小鼠体内表达,研究其趋化与抗肿瘤作用.采用重组DNA技术构建表达质粒;体内进行基因转染,采用RT-PCR鉴定导入基因的表达;通过肝素亲和层析、SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物;腹腔细胞计数、Giemsa染色分析以及肌肉组织切片与染色观察体内基因转染后的趋化作用;小鼠黑色素瘤模型研究基因转染抑制肿瘤的作用.从CH50原核表达载体获得重组多肽的cDNA,5＇端加上小鼠IFN-γ5＇端非编码区和信号肽编码区的cDNA,3＇端加上人FN cDNA的3＇端非编码区;将重组cDNA插入pREP8质粒,即构建出pCH503质粒.巨噬细胞在体内经pCH503转染,然后在体外培养,能够产生CH50多肽.以pCH503分别进行腹腔基因转染和肌肉内基因转染,均可对免疫细胞产生趋化作用;pCH503体内转染可以使小鼠腹腔内黑色素肿瘤结节数降低50%～601.CH50真核表达载体pCH503可在小鼠体内表达,体内基因转染可趋化免疫细胞和抑制肿瘤结节形成,在肿瘤综合治疗中有重要意义.     

CH50真核表达载体pCH503的构建及小鼠体内表达的趋化与抗肿瘤活性

构建重组 FN多肽 CH50真核表达载体并在小鼠体内表达 ,研究其趋化与抗肿瘤作用 .采用重组 DNA技术构建表达质粒 ;体内进行基因转染 ,采用 RT- PCR鉴定导入基因的表达 ;通过肝素亲和层析、SDS- PAGE和 Western blot鉴定表达产物 ;腹腔细胞计数、Giemsa染色分析以及肌肉组织切片与染色观察体内基因转染后的趋化作用 ;小鼠黑色素瘤模型研究基因转染抑制肿瘤的作用 .从 CH50原核表达载体获得重组多肽的 c DNA,5′端加上小鼠 IFN- 5′端非编码区和信号肽编码区的 c DNA,3′端加上人 FN c DNA的 3′端非编码区 ;将重组 c DNA插入 p REP8质粒 ,即构建出p CH50 3质粒 .巨噬细胞在体内经 p CH50 3转染 ,然后在体外培养 ,能够产生 CH50多肽 .以p CH50 3分别进行腹腔基因转染和肌肉内基因转染 ,均可对免疫细胞产生趋化作用 ;p CH50 3体内转染可以使小鼠腹腔内黑色素肿瘤结节数降低 50 %～ 60 % . CH50真核表达载体 p CH50 3可在小鼠体内表达 ,体内基因转染可趋化免疫细胞和抑制肿瘤结节形成 ,在肿瘤综合治疗中有重要意义 .     

HTEA对全脑缺血/再灌注大鼠脑血流及海马细胞凋亡的影响

目的:研究上胸段硬膜外阻滞(high thoracic epidural anesthesia,HTEA)对大鼠全脑缺血再灌注损伤(global cerebral ischemia,GCI)再灌注期间脑血流及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的影响。方法:本研究选用成年雄性Wistar大鼠成功进行T4-5间隙硬膜外置管,并建立四血管阻断的全脑缺血模型进行15 min的全脑缺血。根据通过硬膜外导管输注药物不同,随机分为四组:假手术组(Sham,0.9%生理盐水)、假手术-硬膜外组(Sham-HTEA,0.25%布比卡因)、全脑缺血组(GCI,0.9%生理盐水)和硬膜外组(HTEA,0.25%布比卡因)。给药时间从缺血前15 min开始以20μL/h的速度持续输注至再灌注24 h。缺血前至再灌注2 h观察平均动脉压(MAP)和心率(HR),激光多普勒血流仪监测脑血流(cerebral blood flow,CBF),Western-blot检测再灌注24 h海马凋亡蛋白Bcl-2和Bax含量。结果:HTEA组与GCI组相比,缺血期间及再灌注2 h内的MAP和HR无统计学差异,而与Sham组相比,GCI组的MAP缺血时升高,而再灌注时降低(P0.05);再灌注10 min的高灌注期HTEA组CBF明显低于GCI组(123.1%±35.2%vs 177.5%±32.4%,P0.01),再灌注60 min至120 min的低灌注期的大部分时间点HTEA组CBF均高于GCI组(P0.05);再灌注24 h海马组织Bax/Bcl-2比例明显降低(P0.01)。结论:0.25%的布比卡因20μL·h-1连续上胸段硬膜外阻滞可以维持血流动力学稳定,且可改善大鼠全脑缺血再灌注后低灌注期的脑血流量,并减少再灌注24 h海马Bax/Bcl-2比例。     

纤维结合素分子中Asp1961～Glu1978序列对三结构域多肽在大肠杆菌中表达的影响

构建了人纤维结合素（ＦＮ）的三功能结构域重组多肽的两个表达质粒,分别编码两个重组多肽：ＣＨ６２（ＦＮ的Ｐｒｏ１２３９～Ｓｅｒ１５１５经Ｍｅｔ和Ａｌａ１６９０～Ｖａ１２０４９相连）和ＣＨ６３（从ＣＨ６２中删除了Ｉｌｅ１８５０～Ｇｌｕ１９７８）．ＣＨ６２在大肠杆菌中的表达效率很低,而ＣＨ６３的表达效率则很高,结果提示ＦＮ分子中的Ａｓｐ１９６１～Ｇｌｕ１９７８序列是影响三结构域多肽在大肠杆菌中表达的关键结构．ＣＨ６３经过溶解和复性后,可通过肝素－琼脂糖亲和层析得到纯品,所得纯品具有结合肝素和结合细胞的功能,且结合细胞的能力比双结构域ＦＮ多肽更强,表明两个结合细胞的功能结构域均有活性．ＣＨ６３的制备为进一步研究具有更强的抑制肿瘤转移作用的基因工程制品奠定了基础．     

小鼠体内转染CH50多肽真核表达载体趋化免疫细胞在肿瘤治疗中的作用

目的 研究体内转染表达CH50多肽对免疫细胞的趋化,聚集作用,探讨趋化聚集的免疫细胞增强抗肿瘤以及化疗后抗肿瘤的免疫力。方法 分别在小鼠后肢肌肉,接种肿瘤组织或化疗的肿瘤组织内注射pCH510质粒进行转染,取转染部位组织制备石蜡切片,观察免疫细胞的聚集情况,并观察转染pCH510及联合化疗对肿瘤的治疗作用。结果 正常小鼠后肢肌肉转染pCH510后,注射部位有大量免疫细胞聚集,其中主要是巨噬细胞,淋巴细胞,中性粒细胞,聚集的免疫细胞至少持续存在一周,肿瘤部位转染后,趋化聚集的免疫细胞分布于肿瘤组织周围,抑制了肿瘤细胞的生长,化疗后转染,仍有趋化聚集免疫细胞的作用。免疫细胞聚集数量相对只转染pCH510虽有所减少,但对肿瘤的抑制作用明显增强。结论 本文结果提示,在小鼠体内转染pCH510表达的CH50多肽不仅能够趋化免疫细胞,提高局部抗肿瘤的免疫力,而且与化疗联合作用在肿瘤治疗中具有更大的研究潜力。     

双功能结构域重组FN多肽表达质粒的构建及其表达产物的功能

构建了纤维结合素（ＦＮ）的双功能结构域重组多肽的两个表达质粒,在大肠杆菌中表达了两个重组多肽：ＣＨ５０（ＦＮ的Ｐｒｏ１２３９Ｓｅｒ１５１５经Ｍｅｔ和Ａｌａ１６９０Ｔｈｒ１９６０相连）和ＣＨ５６（ＦＮ的Ｐｒｏ１２３９Ｔｈｒ１９６０）。两个多肽都具有结合肝素的功能,可通过肝素琼脂糖亲和层析得到纯品,所得纯品亦都具有结合细胞的功能。ＣＨ５０和ＣＨ５６的制备为进一步研究其抑制肿瘤转移的作用奠定了基础     

肿瘤细胞混合肽诱导特异性抗肿瘤免疫应答

采用细胞冻融、加热沉淀及酸处理等基本生化技术, 从肿瘤细胞中获取混合 肽; 将热休克蛋白70与肽体外结合, 观察热休克蛋白70-肽复合物对小鼠脾淋巴细胞的激活增殖作用以及增殖的淋巴细胞对瘤细胞的特异性杀伤作用, 并运用流式细胞仪分析增殖的淋巴细胞类型; 分别通过对腹腔和腿部肌肉接种了H22肝癌细胞的BALB/c小鼠进行热休克蛋白70-H22抗原肽复合物免疫注射, 观察小鼠肿瘤的抑制和荷瘤小鼠的生存期情况. 另外, 对免疫的小鼠采血进行肝、肾功能检测. 结果显示, 获取的混合肽中含有肿瘤特异的抗原肽, 其经热休克蛋白提呈后, 体外可刺激淋巴细胞活化增殖, 增殖的淋巴细胞为T淋巴细胞, 对肿瘤细胞有特异性细胞毒效应, 体内对腹水型和实体瘤型肿瘤的生长均可产生显著抑制作用, 同时延长荷瘤小鼠的生存期, 并且这种体内免疫对小鼠肝肾功能不产生影响, 不会引发自身免疫反应.