利用CRISPR-Cas9技术敲除MAS1基因的质粒构建与酶切方案优化的研究

CRISPR-CAS9技术是新一代基因编辑技术,可简便快捷地对哺乳动物细胞进行指定基因的敲除,实现沉默外源基因表达的目的。但传统的CRISPR-CAS9技术提供的酶切方案没有特异性,致使酶切效率不稳定,影响胶回收率以及后续实验。本实验通过改变酶切体系大小,以及酶切反应时间,继而通过胶回收率及测序检测的方法验证最佳酶切条件,最后通过荧光定量PCR和Western blotting实验检测目的基因的表达量,确认是否成功敲除目的基因。研究结果说明:BbsⅠ酶与px459质粒比值为1μL:500 ng,酶切体系为50μL,酶切时间为45 min时,酶切效果最佳、胶回收率最高,且此时目的基因在细胞内的表达量为0,确定该实验条件下目的基因被成功敲除。     

野生灵芝BSU01的分离鉴定、生物学特性及其木质纤维素酶活分析

灵芝作为传统中药,具有重要的医药和经济价值。本研究以一株野生灵芝属真菌BSU01为实验材料,通过形态特征和ITS序列聚类分析对其进行了鉴定,探讨了该菌株菌丝生长的最适碳源、氮源、C/N、pH及温度等生物学特征,以及该菌株产木质纤维降解素酶的能力。结果表明,菌株BSU01的形态特征与有柄灵芝相符;且与有柄灵芝ITS序列一致性达99%,并在系统发育树上聚在一起;菌株BSU01菌丝生长最适碳源为果糖或者葡萄糖,氮源为酵母提取物,C/N比为20/1到30/1,温度为30℃,pH值为5.5;菌株BSU01的漆酶、木质素过氧化物酶和Mn依赖过氧化物酶分别为12.13 U/L、0.52 U/L和0.33 U/L;CMCase和木聚糖酶酶活分别为7.14 U/mL和1.88 U/m L。本研究结果将为该菌的进一步开发利用提供数据参考。     

细菌漆酶的生物信息学分析

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶。本研究利用生物信息学分析工具对细菌的漆酶蛋白序列的基本性质、保守结构域、系统发育树以及结构等进行了分析。所分析细菌主要分布在变形菌门、放线菌和厚壁菌门。细菌漆酶的物理化学性质相似,但不同细菌来源的漆酶之间序列相似性较低,但其仍然具有容易识别的保守结构域特征。二级结构及三级结构具有明显的相似性。细菌漆酶的生物信息分析为其功能研究及在其他微生物中研究该类酶提供了基础。     

联合检测血清NGAL、KIM-1和SCr可有效提高慢性肾病分期诊断

为了探讨中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)和肾损伤分子-1 (kidney injury molecule-1, KIM-1)以及血肌酐(serum creatinine, SCr)联合检测对慢性肾病(chronic kidney disease, CKD)的早期诊断价值,本研究收集260例肾病患者和85例健康体检者,检测其血清NGAL、KIM-1和SCr水平。依据肾功能分级标准,CKD患者分为CKD 1期(53例),CKD 2期(68例),CKD 3期(71例),CKD 4期(46例)和CKD 5期(22例),并分析以上指标在各组间的含量差异,及其联合测定对CKD早期的敏感性。与健康对照组相比较,CKD 1期、CKD 2期、3期、4期和5期患者的NGAL、KIM-1水平均明显升高(p<0.001)。血清SCr含量在CKD 3期、4期和5期组较健康对照组显著增加(p<0.001)。以上3项指标均随着CKD严重程度增加而升高。各组指标阳性率分析显示,3项联合检测阳性率高于单项检测阳性率。ROC曲线分析NGAL、KIM-1、SCr对CKD诊断的AUC值F分别是为0.824、0.805、0.856。相关性分析结果显示,GFR和NGAL、KIM-1、SCr相关系数分别是r=-0.784、-0.756、-0.728 (p<0.05)。NGAL与KIM-1、SCr的相关系数分别是r=0.932、0.764 (p<0.05);KIM-1与SCr的相关系数r分别是0.791 (p<0.05)。本研究初步得出结论:血清NGAL、Kim-1可作为CKD早期诊断的重要指标,联合检测血清NGAL、Kim-1、SCr可有效提高CKD早期肾损伤诊断的敏感度,对CKD的分期诊断和治疗具有极其重要的临床价值。     

偶联羟化反应和辅酶再生体系产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,可以用来制备β-甾酮,地塞米松和其他类固醇化合物。3-甾酮9α-羟基化酶(KSH)是由两个亚基即末端氧化亚基(KshA)和铁氧还蛋白还原亚基(KshB)构成的。在本研究中,人工合成了来源于分枝杆菌Mycobacterium sp.Strain VKM Ac-1817D的kshA和kshB基因,通过优化表达载体促进了KshA和KshB在E.coli BL21(DE3)中的可溶性表达,并探究了催化体系中KSH还原亚基和氧化亚基的最适添加比例。此外,KSH转化雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)为9-OH-AD的过程中需要辅酶NADH。本研究构建了羟基化反应与利用葡萄糖脱氢酶(GDH)的NADH辅酶再生反应的偶联体系。为了进一步提高转化效率,本研究进行了转化条件的优化,并采取了分批补料的策略,最终9-OH-AD产量为4.78 g/L,转化率为96.7%。此种酶介导的转化生产9-OH-AD的方法为甾体药物生产提供了一种环境友好和经济实用型的新策略。     

镧胁迫下外源H2O2对裸燕麦幼苗叶绿素荧光参数和光合碳同化酶活性的影响

稀土污染已成为制约农业发展的一种重要因素,为探讨外源过氧化氢(H_2O_2)缓解裸燕麦镧(La)胁迫伤害的光合生理机制,以‘白燕7号’裸燕麦幼苗为材料,采用砂培方法,研究了5 mmol/L H_2O_2喷施预处理对1.20 mmol/L La~(3+)胁迫下裸燕麦幼苗生长、叶片叶绿素荧光参数和碳同化关键酶活性的影响。结果表明:La胁迫下,H_2O_2预处理的裸燕麦幼苗根长、株高和生长量的降幅及叶片叶黄素循环脱环氧化状态(A+Z)/(V+A+Z)显著下降,PSⅡ最大光化学效率(F_v/F_m)、实际光化学效率(Φ_(PSⅡ))、光化学猝灭系数(qP)和吸收光能用于光化学反应的份额(P)显著提高,PSⅡ非光化学猝灭系数(NPQ)、调节性能量耗散Y(NPQ)、非调节性能量耗散Y(NO)、吸收光能用于天线热耗散的份额(D)、PSⅡ反应中心非光化学耗散的份额(E_x)和双光系统间激发能分配不平衡偏离系数(β/α-1)明显降低,同时1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)、1, 7-二磷酸景天庚酮糖酯酶(SBPase)和1, 6-二磷酸果糖醛缩酶(FBAase)活性显著提高,但转酮醇酶(TKase)活性无显著变化。表明外源H_2O_2能够通过提高PSⅡ光化学效率和碳同化关键酶活性而非依赖叶黄素循环的热耗散来减轻La胁迫导致的光抑制,从而缓解La胁迫幼苗生长的受抑程度,增强裸燕麦对La胁迫的适应性。     

微生物1,3-1,4-β-葡聚糖酶蛋白质改造及工业应用研究进展

1,3-1,4-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.73)是一种重要的工业用酶,其可以通过特异性切割毗邻β-1,3-糖苷键的β-1,4-糖苷键将β-葡聚糖或地衣多糖降解为纤维三糖和纤维四糖。微生物β-葡聚糖酶属于糖苷水解酶家族16,其三维结构为卷心蛋糕状的逆向β-片层结构。文中综述了近些年来β-葡聚糖酶在工业上的应用情况及酶蛋白质工程改造的研究进展,并对其研究前景进行了展望。     

发酵透明质酸寡糖兽疫链球菌工程菌株的构建

透明质酸(HA)广泛应用于医学、化妆品、食品等领域。HA的生物活性取决于其分子量(M_w)。透明质酸寡糖由于具有重要的生理活性与特殊生理功能,在医药领域具有重要的应用前景。兽疫链球菌因其发酵周期短、生产强度较强的特点,在商业生产HA上具有广泛的应用。为了高效发酵合成透明质酸寡糖和解决发酵过程的溶氧问题,文中通过在兽疫链球菌WSH-24中过表达透明质酸合酶HasA以及优化表达水蛭来源的透明质酸酶LHAase。重组菌株摇瓶发酵24h,透明质酸寡糖积累至0.97g/L,比野生菌提高了182.0%。在3L发酵罐中发酵24 h,透明质酸寡糖生产强度为294.2 mg/(L·h),HA积累至7.06 g/L,比野生菌的罐上水平提高了112.4%。文中所构建的发酵合成透明质酸寡糖的兽疫链球菌重组菌株具有重要的应用前景。     

施用生物炭6年后对稻田土壤酶活性及肥力的影响

利用田间定位试验,研究0(BC₀)、7.5(BC₁)、15(BC₂)和22.5(BC₃)t·hm^-2水稻秸秆生物炭及3.75 t·hm^-2水稻秸秆(STR)一次性施加6年后对稻田土壤肥力及酶活性的影响.结果表明: 施用生物炭6年后土壤有机碳、有效磷和速效钾含量显著增加,增幅分别为34.6%、12.4%和26.2%,土壤pH值和容重显著降低,但对土壤全氮含量无显著影响.土壤脲酶和酸性磷酸酶的活性显著增加,土壤荧光素二乙酸酯酶(FDA水解酶)和芳基硫酸酯酶的活性受到不同程度的抑制,其中,BC₂处理的土壤脲酶活性增加量最大,增幅为36.5%.土壤酸性磷酸酶活性随着生物炭施加量的增加而增加,与土壤速效磷含量呈显著正相关关系;土壤FDA水解酶和脲酶主要与土壤速效钾含量有关;酸性磷酸酶和芳基硫酸酯酶与土壤容重呈显著正相关.施用生物炭6年后土壤脱氢酶和多酚氧化酶活性明显升高,增幅分别为48.8%和27.5%,而过氧化氢酶活性逐渐下降,且显著低于对照BC₀.STR处理显著增加了土壤脲酶、FDA水解酶、脱氢酶、酸性磷酸酶和芳基硫酸酯酶的活性,降低了过氧化氢酶和多酚氧化酶的活性,降幅分别为23.4%和15.9%.