利用CRISPR-Cas9技术敲除MAS1基因的质粒构建与酶切方案优化的研究

CRISPR-CAS9技术是新一代基因编辑技术,可简便快捷地对哺乳动物细胞进行指定基因的敲除,实现沉默外源基因表达的目的。但传统的CRISPR-CAS9技术提供的酶切方案没有特异性,致使酶切效率不稳定,影响胶回收率以及后续实验。本实验通过改变酶切体系大小,以及酶切反应时间,继而通过胶回收率及测序检测的方法验证最佳酶切条件,最后通过荧光定量PCR和Western blotting实验检测目的基因的表达量,确认是否成功敲除目的基因。研究结果说明:BbsⅠ酶与px459质粒比值为1μL:500 ng,酶切体系为50μL,酶切时间为45 min时,酶切效果最佳、胶回收率最高,且此时目的基因在细胞内的表达量为0,确定该实验条件下目的基因被成功敲除。     

绞股蓝鲨烯环氧酶基因的克隆与序列分析

根据已报道植物鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因cDNA序列的保守区域设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,对绞股蓝SE基因进行克隆及序列分析.结果表明,绞股蓝SE基因cDNA全长为1 818 bp,编码一个由525个氨基酸残基组成的多肽.绞股蓝SE基因编码的氨基酸序列中含有52.4%的非极性疏水性氨基酸,26.1%极性中性氨基酸,9.0%酸性氨基酸,12.6%碱性氨基酸.Blast结果显示,绞股蓝SE基因核苷酸序列与其他已报道的植物SE基因相似性为73%～82%,推导的氨基酸序列相似性为63.2%～79.4%.SE氨基酸序列进化分析发现,绞股蓝SE与绿珊瑚、拟南芥亲缘关系较近.     

三七鲨烯合酶基因在三七根、茎、芦头中的转录表达与三萜皂苷合成

三萜皂苷是三七、人参等重要药用植物的主要有效成分．采用改进的异硫氰酸胍法提取到三七RNA,经RT-PCR克隆技术获得三七三萜合成通路关键酶之一鲨烯合酶(squalene synthase, SS) cDNA,长1 270 bp,读码框架编码415个氨基酸．比对分析表明,推衍的三七SS氨基酸序列与人参、积雪草、青蒿、拟南芥和水稻SS的一致性分别为98%、89%、81%、78%和71%．利用实时荧光定量RT-PCR技术对三七根、茎、芦头的SS转录表达研究发现,一年生三七根SS基因转录表达量最高,高于茎和芦头的表达;但总皂苷含量是:芦头>叶>根>茎．可能与SS之后其它三萜合成关键酶的活性差异或/和三萜合成后的定向输送及累积有关．     

三七植物GAPDH基因克隆及序列分析

采用改进的异硫氰酸胍法提取高质量三七总RNA,运用RT-PCR方法克隆了三七GAPDH基因的部分序列,长度为627 bp,编码209个氨基酸,为半定量RT-PCR以及Real-time RT-PCR等技术在三七植物研究中的应用提供了条件.氨基酸序列比对结果表明,该序列与拟南芥、烟草、人参的GAPDH氨基酸序列的同源性分别为91%、93%、95%;核苷酸序列的同源性分别为82%、84%、85%.     

三七法呢基焦磷酸合酶原核表达载体的构建及其表达

在克隆得到三七法呢基焦磷酸合酶(FPS)cDNA的基础上,构建原核表达载体pET32a(+)/FPS,并转化大肠杆菌BL21(DE3)受体菌,在37℃,1 mmol/L IPTG浓度条件下,诱导表达FPS融合蛋白,对诱导表达条件进行了优化.结果表明:成功构建了原核表达载体pET32a(+)/FPS,并在大肠杆菌中成功表达FPS蛋白,分子量约为40 kD,为进一步开展FPS的蛋白纯化和功能分析奠定了基础.     

三七与其它植物FPS序列的比较分析

三萜皂甙是中药三七（Panax notoginseng）的主要有效成分,为阐明三七三萜皂甙合成途径中法呢基焦磷酸合酶（FPS）的结构特征,采用RT-PCR及3-＇RACE和5′-末端分析法,对三七FPS进行克隆,获得三七FPS cDNA全长,已提交GenBank,登录号为DQ059550;结合生物信息数据库及相关分析软件,对三七根FPS进行性质预测,并与GenBank中记载的植物FPS进行比对分析,构建了植物FPS系统进化树,进行聚类关系分析,根据FPS聚类关系将这些植物异戊二烯类物质合成途径的产物分组.结果表明,植物FPS有2个保守核心区,分别为DDIMD和QVQDDYLD;比对分析及构建的系统进化树表明,三七与人参、积雪草的FPS序列一致性分别为99%、95%,其三萜物质结构也相似.     

RAPD 技术在药用植物绞股蓝鉴别中的初步研究

运用RAPD技术对绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)及其伪品进行DNA指纹图谱的鉴别研究.采用改进的CTAB法提取七叶绞股蓝、五叶绞股蓝、乌蔹莓(Cayratia japonica)3种植物的总DNA,主要以七叶绞股蓝DNA为模板,采用随机引物WGS001进行PCR扩增,对反应体系包括模板、Mg2 、Taq酶、牛血清白蛋白(BSA)、退火温度进行优化.优化的反应体系总体积25 μL ,含MgCl2 2 mmol/L、dNTP 0.2 mmol/L、引物 0.4 μmol/L、模板60 ng、Taq 酶1 U、BSA 2 μg/μL,退火温度58℃.用10条含20个碱基的随机引物对以上3种植物总DNA作PCR扩增,进行引物筛选.筛选得到的两条随机引物(WGS001、WGS004)可扩增得到识别这些物种基因组DNA的多态性片段.这些片段可以有效地鉴别绞股蓝和乌蔹莓.