生长抑素受体基因特异性shRNA慢病毒表达质粒的构建

目的:设计并合成生长抑素受体SSTR5基因siRNA序列,并构建其短发夹shRNA慢病毒表达质粒.方法:以小鼠SSTR5基因为靶序列,用在线软件分析、设计并合成其有效siRNA,退火形成双链DNA后,与经BamH I和EcoR I双酶切线性化慢病毒表达载体pSHR-Pμro/GFP连接,产生pLV-shSSTR5重组慢病毒质粒.将重组质粒转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.结果:构建的重组表达质粒PCR产物为161bp,其中插入的SSTR5-siRNA片段为61bp,测序结果与参考序列完全一致.结论:成功构建了小鼠SSTR5基因特异性shRNA慢病毒表达质粒,为进一步采用RNAi技术研究小鼠SSTR5基因表达对其生长情况的影响奠定了基础.     

降胆固醇植物乳杆菌的紫外诱变选育

通过对植物乳杆菌进行紫外线诱变处理,采用胆固醇梯度平板的初筛方法和体外降胆固醇能力的测试,结果得到二株降胆固醇能力强且性能比较稳定的植物乳杆菌突变菌株Lp-UVs 29和Lp-UVs 44,胆固醇的降解率分别为48.7%和44.2%,分别比诱变前提高了97.97%和79.67%.     

PTD融合蛋白的原核表达及其抗体制备

目的：为制备凋亡素重组蛋白抗体,首先获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,而且通过原恢表达系统表达重组蛋白并制备其抗体,为进一步利用凋亡素重组蛋白导向治疗肿瘤的检测奠定基础。方法：应用重叠延伸的基因融合技术将LHRH（黄体生成激素释放激素）基因、TAT（HW—1反式转录激活因子）基因和凋亡素基因重组,构建成凋亡素重组蛋白原核表达载体pET-28α～LTA,随后将表达质粒转入BL21菌株,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,将已表达的重组蛋白通过Ni—NTA亲和色谱柱进行纯化,并制备LTA凋亡素重组蛋白抗体。结果：表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测．LTA蛋白融合基因获得高效表达,凝胶薄层扫描分析表明表达蛋白占菌体蛋白12．6％。LTA蛋白经Ni—NTA亲和色谱柱柱纯化,以纯化蛋白为抗原免疫獭兔制备凋亡素重组蛋白抗血清。结果表明抗体的效价为1：12800。结论：应用重叠延伸的基因融合技术获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,通过原核表达系统表达重组蛋白并制备其抗体。     

基于TaqMan探针的蜜蜂囊状幼虫病病毒荧光PCR检测方法的建立和应用

为建立快速有效的蜜蜂囊状幼虫病检疫方法, 依据TaqMan荧光标记探针技术原理, 针对蜜蜂囊状幼虫病病毒保守序列, 设计出一对特异性引物和一条探针, 建立了一种快速检测蜜蜂囊状幼虫病病毒的荧光PCR方法。该方法对蜜蜂囊状幼虫病的检测具有较好的特异性, 与蜜蜂急性麻痹病病毒、蜜蜂慢性麻痹病病毒、蜜蜂残翼病病毒和黑蜂王台病病毒之间均无交叉反应。检测灵敏度可达1.0×10²拷贝/μL阳性质粒, 可对低病毒含量的样品进行准确检测。重复性和稳定性试验结果显示, 变异系数为1.6%, 说明该方法具有较好的重复性和稳定性。应用该方法对蜜蜂及蜂制品进行检测, 结果显示所建立的荧光PCR检测方法4 h内即可报告检测结果, 该方法具有快速、灵敏、特异及重复性好等优点, 适用于蜜蜂及其制品中蜜蜂囊状幼虫病病毒的快速检疫。     

应用噬菌体GH15和K治疗金黄色葡萄球菌感染

[目的]研究金黄色葡萄球菌噬菌体GH15和K的生物学特性及联合用于治疗金黄色葡萄球菌感染的潜力.[方法]通过透射电镜观察噬菌体GH15和K的形态;测定二者的裂解谱和一步生长曲线;通过体外裂解实验和体内治疗实验分别测定单独使用GH15、K及二者混合使用时的裂解能力和对菌血症小鼠的保护效果.[结果]通过电镜观察发现两个噬菌体的外形相似,但GH15的尾部比K的长.GH15裂解谱较宽,可以裂解28株金葡菌,而K仅能裂解7株金葡菌.通过对两株噬菌体感染7株共同宿主菌形成的一步生长曲线进行拟合曲线分析,表明二者对不同宿主菌的增殖趋势是不同的.在体外,混合噬菌体与单个噬菌体的抑菌活性无明显差别;在体内实验中,混合噬菌体表现出优于单个噬菌体的治疗效果,用较低的剂量即可以达到高剂量单个噬菌体的治疗效果.[结论]GH15和K所形成的混合噬菌体在治疗金黄色葡萄球菌感染具有更大的应用潜力.     

RNA复制子疫苗研究进展

最近兴起的RNA复制子疫苗,利用源自病毒的能够自主复制的RNA,其结构蛋白基因由外源抗原基因取代,保留了非结构蛋白(RNA复制酶)基因。RNA复制酶可使RNA载体在细胞质中高水平复制,并实现外源抗原基因的高水平表达,可同时诱导细胞免疫和体液免疫应答。大量双链RNA可诱导被感染细胞凋亡,宿主细胞的凋亡有利于免疫系统识别外源抗原。RNA复制子疫苗克服了传统疫苗和普通DNA疫苗存在的缺点,具有抗原表达效率高、安全性好、应用范围广等优点,因而被视为一种发展前景很好的疫苗形式。目前已对一些疾病模型基于复制子的治疗性和预防性疫苗进行了研究(涉及的对象包括病毒、肿瘤以及细菌毒素等),并对某些不足之处进行了改进。     

隐睾小鼠与正常成年小鼠睾丸蛋白表达谱的差异分析

为使精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）在体外大量扩增,需要阐明SSCs自增殖机制。为筛选SSCs自增殖相关因子,探索SSCs自增殖机制,本研究选取10日龄昆明乳鼠行隐睾手术,术后35d分别取小鼠两侧睾丸。组织学分析结果显示,实验性隐睾中生殖细胞的分化停滞在精母细胞阶段,且只有少量的精母细胞出现,精原细胞的比例高于正常成年雄性小鼠（45日龄）。应用双向凝胶电泳分析隐睾小鼠与正常成年小鼠睾丸差异表达蛋白。结果显示,与正常成年小鼠相比,隐睾小鼠睾丸中有9种蛋白表达发生了显著变化,其中6种蛋白表达下调,3种上调。对9种差异表达蛋白点胶内酶切后进行质谱分析,其中4种蛋白分别鉴定为磷脂酰乙醇胺结合蛋白1（phosphatidylethanolamine-binding protein1,PEBP1）,HES—related basic helix-100p-helix protein（HERP）,Stathmin蛋白和一种未命名蛋白。本研究通过制作有效的隐睾动物模型,运用蛋白组学的技术方法,成功筛选并鉴定了4种隐睾相关蛋白,有助于探讨SSCs自增殖及隐睾引起雄性不育的机制。     

α-2,6唾液酸转移酶(ST6Gal1)的cDNA克隆、原核表达及生物活性研究

从HepG2细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增α-2,6唾液酸转移酶基因,构建于pMD-18T克隆载体中,经序列测定后与GenBank中报道的已知序列比对完全一致,再将已知目的序列插入原核表达载体pET-28a(+)中。将构建正确的原核表达载体转化表达受体菌BL21（DE3）中,IPTG诱导其进行表达并鉴定目的蛋白,对鉴定正确的目的蛋白复性后经Ni2 +亲和层析柱纯化获得高纯度的α-2,6唾液酸转移酶蛋白。然后用霍乱弧菌神经氨酸酶处理健康鸡红细胞,清除鸡红细胞表面所有类型的唾液酸寡糖链;再用表达的α-2,6唾液酸转移酶以 CMP-唾液酸作为底物在霍乱弧菌神经氨酸酶处理的鸡红细胞表面标记上SAα2,6 Gal受体。将标记有SAα2,6Gal受体的鸡红细胞应用微量血凝试验和流式细胞仪进行检测,以验证所表达蛋白的生物活性。结果表明,原核表达的α-2,6唾液酸转移酶具有较好的生物活性。     

比格犬ERβ1293基因真核载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达和定位

目的 观察比格犬Myc 标签ERβ1293重组真核表达载体在HEK293T细胞中的表达及定位.方法 以pEGFP-N1-ERβ1293重组真核表达载体为模板,PCR保真酶扩增得到ERβ1293基因编码区全长.Myc标签ERβ1293重组真核载体瞬时转染HEK293T细胞,运用蛋白质印迹技术（Western blotting）和间接免疫荧光技术（indirect immunofluorescence,IF）鉴定pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T细胞中的表达和定位情况.结果 成功构建pcDNA3.1-Myc-ERβ1293重组真核表达载体,转染至HEK293T细胞中.Western blotting检测有蛋白条带表达,共聚焦显微镜下观察IF处理后的转染细胞,荧光定位于细胞质.结论 前期实验得到比格犬ERβ剪切异构体ERβ1293编码区序列,缺失第四外显子,导致其与配体结合能力减弱或消失,因此目的 基因编码蛋白定位在细胞中发生变化.     

定点突变提高D-氨甲酰水解酶的可溶性表达

采用定点突变的方法对皮氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pickettii)来源的D-氨甲酰水解酶(D-carbamoylase,DCase)编码基因的3个位点A18、Y30、K34进行突变,并将获得的突变体基因片段构建入高表达载体pET-28b中,转化E coli BL21( DE3),获得带有组合三突变(A18E/Y30D/K34E)的DCase-SM表达菌株BL21/pET-DCSM.当以IPTG诱导目的蛋白表达时,发现突变菌株(DCase-SM)与出发菌株(DCase)菌株相比,目的蛋白的可溶性表达显著提高,其可溶蛋白比例约为64％;与出发菌株相比,其单位菌体酶活增加427％;另外,与本实验室前期构建的高可溶性三叠加突变体菌株DCase-M3相比,单位菌体酶活亦增加7.9％.