PTD融和蛋白的原核表达及其抗体制备

目的:为制备凋亡素重组蛋白抗体,首先获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,而且通过原核表达系统表达重组蛋白并制备其抗体,为进一步利用凋亡素重组蛋白导向治疗肿瘤的检测奠定基础.方法:应用重叠延伸的基因融合技术将LHRH(黄体生成激素释放激素)基因、TAT(HIV-1反式转录激活因子)基因和凋亡素基因重组,构建成凋亡素重组蛋白原核表达载体pET-28a-LTA,随后将表达质粒转入BL21菌株,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,将已表达的重组蛋白通过Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化,并制备LTA凋亡素重组蛋白抗体.结果:表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,LTA蛋白融合基因获得高效表达,凝胶薄层扫描分析表明表达蛋白占菌体蛋白12.6%.LTA蛋白经Ni-NTA亲和色谱柱柱纯化,以纯化蛋白为抗原免疫獭兔制备凋亡素重组蛋白抗血清.结果表明抗体的效价为1: 12800.结论:应用重叠延伸的基因融合技术获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,通过原核表达系统表达重组蛋白并制备其抗体.     

抗对硫磷基因工程新型抗体的制备及初步鉴定

摘要: 【目的】提高抗对硫磷抗体的亲和力以提高酶联免疫检测的灵敏度。【方法】本研究通过抗对硫磷单链抗体基因和核心链霉亲和素基因片段的拼接重组,获得抗对硫磷单链抗体-核心链霉亲和素融合基因（scfv-sa）,并将该融合基因（scfv-sa）插入到表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行原核表达,制备融合蛋白。SDS-PAGE和Western blot鉴定scfv-sa的表达,Ni+-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,并用ELISA方法测定该融合抗体的亲和力。【结果】结果表明,在大肠杆菌BL21（DE3）中该融合基因能表达出分子量约为46kD的融合蛋白,形成了四价结构域-四价聚合抗体。ELISA测定结果表明该抗体能与对硫磷特异结合,抗体效价在1:1×106以上,亲和常数为4.25×107 L /mol。 【结论】制备的抗对硫磷四价聚合抗体能与抗原特异结合,与单克隆抗体相比,抗原结合位点显著增加,ELISA检测灵敏度显著提高。     

抗对硫磷基因工程新型抗体的制备及鉴定

【目的】提高抗对硫磷抗体的亲和力以提高酶联免疫检测的灵敏度。【方法】本研究通过抗对硫磷单链抗体基因和核心链霉亲和素基因片段的拼接重组,获得了抗对硫磷单链抗体-核心链霉亲和素融合基因(scfv-sa),并将该融合基因(scfv-sa)插入到表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达,制备融合蛋白。SDS-PAGE和Western blot鉴定scfv-sa的表达,Ni+-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,并用ELISA方法测定该融合抗体的亲和力。【结果】结果表明,在大肠杆菌BL21(DE3)中该融合基因能表达出分子量约为46kDa的融合蛋白,形成了四价结构域-四价聚合抗体。ELISA测定结果表明该抗体能与对硫磷特异结合,抗体效价在1:1×106以上,亲和常数为4.25×107L/mol。【结论】制备的抗对硫磷四价聚合抗体能与抗原特异结合,与单克隆抗体相比,抗原结合位点显著增加,ELISA检测灵敏度显著提高。     

硫氧还蛋白抗体柱的制备

目的:探索硫氧还蛋白(Trx)抗体柱对Trx融合蛋白纯化的可行性。方法与结果:对含有Trx基因的质粒表达载体pTrxFus进行改造,在Trx读框之后加入6×His序列,并在大肠杆菌中表达C端带有6×His标签的Trx,经Ni2+柱亲和纯化后制备多克隆抗体;把经蛋白A纯化后的抗体偶联在溴化氰活化的琼脂糖凝胶上,制成Trx抗体柱;用此抗体柱纯化与Trx融合表达的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI),SDS-PAGE结果显示获得了纯度较高的Trx-CpTI。结论:用Trx抗体制成的免疫亲和层析柱可以有效纯化Trx融合蛋白。     

3种纯化重组禽流感病毒NS1抗原方法的比较

目的：摸索出最佳分离纯化和复性重组禽流感病毒NS1抗原的方法,得到高纯度的重组蛋白。方法：将重组质粒pET32a—NS1转染大肠杆菌BL21（DE3）后获得表达,分别以尿素变性、复性,Ni—NTA His．Bind Resin亲和,以及脱氧胆酸钠-N-十二烷基肌氨酸钠（DOC—SKL）洗涤溶解等3种纯化方法从表达产物包涵体中分离纯化NS1蛋白,并进行比较研究。结果：原核表达得到相对分子质量约45000的目的蛋白;3种纯化方法均能分离和纯化出NS1重组蛋白,其中尿素纯化的蛋白纯度为50％～60％,Ni—NTA His．Bind Resin亲和纯化的蛋白纯度为80％-90％,DOC-SKL纯化的蛋白纯度达95％以上;Western blot检测表明,复性后的纯化蛋白具有良好的生物学活性。结论：应用十二烷基肌氨酸钠洗涤纯化是最佳的纯化NS1蛋白的方法,所获得的蛋白可作为包被ELISA的抗原。     

拟南芥MnSOD的原核表达、纯化及抗体制备

PCR扩增拟南芥MnSOD cDNA的保守区段,构建pET-SOD重组质粒,转化大肠杆菌JM109(DE3),IPTG诱导融合蛋白高效表达;经检测表达产物占菌体总蛋白的69％,且以不溶的包涵体形式存在;表达产物变性后经Ni—NTA Superflow亲和柱分离纯化,得到相对分子质量约为29000的PAGE纯蛋白。融合蛋白经还原复性处理后,比活达到200U／mg;免疫家兔制备MnSOD融合蛋白抗体,抗体效价为1：10000。以上结果为进一步大规模制备MnSOD及其功能研究奠定基础。     

Nodal蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

斑马鱼心脏发育模型中Nodal编码转录因子调节心脏的左右不对称发育,为了进一步研究Nodal信号途径在心脏发育中的调控作用和心脏疾病发生的分子机制,需要获得斑马鱼Nodal蛋白并制备其抗体.采用从斑马鱼心脏组织中提取RNA,通过反转录得到心脏组织各种表达基因的cDNA为模板,PCR扩增得到Nodal部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达.经酶切及测序鉴定后,转化Rosseta细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体.获得了Nodal原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Nodal多克隆抗体,为Nodal功能的进一步研究奠定了基础.     

肺炎链球菌假想蛋白SPD0873的表达纯化及保守性分析

目的通过构建原核表达载体,获得纯化的肺炎链球菌S．pn重组假想蛋白SPD0873,并制备多克隆抗体,进一步分析其在常见S．pn菌株中的保守性。方法分离培养D39型肺炎链球菌,获取其基因组DNA。利用PCR方法扩增去除信号肽的spd0873序列,采用基因体外重组法将spd0873序列克隆到原核表达载体pET-32（a）内,测序鉴定。将重组质粒转化到E．coli Rossetta（DE3）中,经IPTG诱导大量表达融合6个组氨酸标签的SPD0873重组蛋白,经Ni—NTA树脂纯化后,获得的重组蛋白用SDS—PAGE和Western印迹鉴定;将鉴定后纯化的蛋白免疫BALB／C小鼠制备多克隆抗体,并用间接ELISA检测多克隆抗体的效价,Western印迹方法分析多克隆抗体的特异性,同时,鉴定该蛋白在5种常见肺炎链球菌分离株的保守性。结果克隆的spd0873序列与GenBank中的数据相符,并实现了SPD0873蛋白高水平的可溶表达。纯化蛋白免疫BALB／C小鼠获得高滴度、高特异性的的多克隆抗体,Western印迹验证SPD0873蛋白在5株常见肺炎链球菌菌株中均有表达。结论成功制备了高滴度、高特异性的SPD0873蛋白多克隆抗体,同时,检测到SPD0873蛋白在5种常见的肺炎链球菌菌株中非常保守,为研究该蛋白的生物学功能及肺炎链球菌多肽联合疫苗的研制奠定了基础。     

果蝇心脏发育标记基因Hand多克隆抗体的制备

制备果蝇心脏标记基因Hand抗体对研究果蝇心脏发育具有重要意义。从果蝇体内提取出总RNA,反转录得到果蝇的cDNA,将其作为模板PCR得到Hand基因部分片段,将片段连接到pET-28a上,构建重组质粒pET一28a—Hand,将重组质粒转化rosetta受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化,SDS—PAGE电泳分析,结果表明Hand基因在大肠杆菌中成功表达,表达的Hand融合蛋白分子量大约为24kD,经镍柱纯化后获得了高纯度可溶性的Hand蛋白。     

脂联素及其球状区在大肠杆菌中的可溶性表达

目的:克隆表达有生物学活性的脂联素及其球状区蛋白,并制备抗体。方法:以pQE30-adiponectin质粒为模板,PCR扩增脂联素及其球状区蛋白基因片段,插入pGEX-4T-2载体,转化大肠杆菌BL21后获得表达,用GSTrap柱亲和纯化可溶性表达的蛋白。用纯化的蛋白免疫家兔制备多抗,Westernblot鉴定抗体与人血清中脂联素的反应性。结果:PCR扩增脂联素基因片段长约710bp,脂联素球状区基因片段长约430bp。表达的GST-脂联素融合蛋白表观Mr约51000,GST-脂联素球状区融合蛋白表观Mr约42000,纯化后纯度高于90%。免疫产生的抗体与人血清中的脂联素能特异性结合。结论:表达获得的脂联素蛋白和制备的抗体为脂联素的检测及对其功能的研究奠定了基础。     

羊口疮病毒蛋白ORFV035的表达、纯化和多克隆抗体的制备

克隆表达羊口疮病毒蛋白ORFV035,并制备其多克隆抗体,为后续对病毒复制、装配、形态发生和成熟过程的研究奠定基础。PCR扩增羊口疮病毒ORFV035基因,将其与质粒pET-30a(+)经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后连接,构建重组质粒pET30a-035。重组质粒经双酶切和测序鉴定,转化感受态大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。表达产物进行超声破碎和Ni柱纯化,纯化后目的蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体并对其进行鉴定。成功构建了重组质粒pET30a-035,在大肠杆菌BL21中以包涵体形式高效表达。包涵体洗涤、溶解后进行Ni柱纯化,得到纯度较高的ORFV035-his融合蛋白。以纯化蛋白免疫小鼠获得多克隆抗体。Western blot检测显示该多抗可以识别天然ORFV035蛋白。成功诱导表达、纯化ORFV035蛋白并制备ORFV035多克隆抗体。     

表达VP3重组减毒沙门氏菌的构建和融合蛋白纯化

寻求有效的肿瘤基因疗法,构建鸡贫血病毒VP3的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗,并获得较纯的表达VP3基因的融合蛋白,初步研究其免疫原性.采用PCR技术扩增VP3基因,并将其与原核载体pET32α( )重组.将重组后质粒转染E.coli BL21,得到表达VP3的融合蛋白,并将此蛋白通过50%的Ni -NTA亲和树脂纯化.同时将重组质粒转染减毒沙门氏菌SL7207.经双酶切和PCR鉴定,成功构建了表达VP3的减毒沙门氏菌苗.融合蛋白通过50%的Ni -NTA亲和树脂纯化,得到纯度在90%以上的纯化蛋白.成功构建了表达VP3的减毒沙门氏菌苗,并且获得纯化的表达VP3的融合蛋白,为进一步研究VP3的免疫保护作用及对抗肿瘤疫苗的研制打下基础.     

菠菜SoHb基因的原核表达及功能分析

为了进一步揭示菠菜非共生血红蛋白(SoHb)的功能,通过RT-PCR的方法从菠菜根中克隆了SoHb基因编码区全长序列,并将其克隆到原核表达载体pET32a上,构建原核表达载体p ET32a-SoHb,并转化大肠杆菌BL21 star(DE3)获得原核表达工程菌株。通过IPTG法诱导该重组质粒在大肠杆菌中得到高效表达,融合蛋白分子质量约为38 kDa,且在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经Ni2+NTA亲和柱纯化,获得纯化的融合蛋白。与空载体相比,重组菌对硝化胁迫的抗性增加。以纯化的融合蛋白为抗原免疫昆明小鼠,制备多克隆抗体,并对其进行了Western blot检测。实验结果为进一步研究菠菜SoHb基因功能奠定了基础。     

果蝇odd蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备研究

odd是一个新发现的心脏特异表达基因。为了进一步研究odd在心脏发育中的功能,根据已报道的odd基因序列,以果蝇cDNA文库为模板进行PCR扩增,将所得的odd部分编码区序列连接到pET-28a载体上构建原核表达载体;重组子经酶切测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,纯化后的His-odd融合蛋白免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体,Western Blot检测抗体活性。结果表明,获得了odd原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Odd多克隆抗体,为后续的odd功能研究奠定了基础。     

SDHB蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

SDHB(succinate dehydrogenage complex,subunit B)基因可能介导呼吸链生物功能和调控细胞生长.采用PCR技术扩增出SDHB基因,并将其连接到pGEX-4T-1原核表达载体中,经酶切及测序鉴定后,转化BL21细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体.获得了SDHB原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗SDHB多克隆抗体,为SDHB进一步的功能研究奠定了基础.     

果蝇心脏发育标记基因lbe的多克隆抗体制备

lbe是已经证明的心脏标记基因。为了深入研究lbe在心脏发育中的功能,需要获得lbe蛋白并制备其抗体。首先提取野生型成体果蝇的总RNA,反转录获得其cDNA文库,通过PCR克隆出lbe编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上。经酶切及测序鉴定后,质粒构建成功。将重组质粒（pET-28a-lbe）转化大肠杆菌菌株Rosseta,用IPTG诱导表达出融合蛋白,经Ni-IDA凝胶柱纯化后,最后将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备lbe多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体的效价和特异性。结果显示获得了lbe原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗lbe多克隆抗体,为lbe功能的进一步研究奠定了基础。     

ORP4L多克隆抗体的制备及其在蛋白质组学研究中的应用水

目的：原核表达并纯化人氧化固醇结合蛋白相关蛋白4（ORP4L）肽段,制备兔抗人ORP4L多克隆抗体,并利用其进行蛋白质组学研究。方法：应用PCR技术扩增人ORP4L382-485氨基酸（ORP4Lm）的基因序列并插入到PGEX-4T—1载体中,在大肠杆菌RosettaTM（DE3）中表达融合蛋白GST-ORP4Lm。利用所表达的融合蛋白中含有的GST标签进行亲和纯化。用所获得的纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得兔抗人ORP4L多克隆抗体。用Western blotting检测抗体免疫特异性。将亲和纯化后的抗体偶联到CNBr-actived sepharosC beads上,利用免疫沉淀的方法,通过质谱仪分析鉴定可能与ORP4L存在相互作用的蛋白质。通过West—ernblotting进一步确证特异性的相互作用蛋白。结果：在大肠杆菌中表达并纯化了GST-ORP4Lm重组蛋白,用其免疫新西兰大兔．成功制备了相应兔源多克隆抗体,Western blotting证实该抗体可以特异识别内源性及外源性的ORP4L蛋白。质谱分析和Western blotting的结果表明所制备的多克隆抗体可以用于蛋白质组学研究。结论：利用重组的GST-ORP4Lm融合蛋白成功制备了有良好特异性的ORP4L多克隆抗体,并可将其用于ORP4L的蛋白组学研究。     

新型冠状病毒S蛋白RBD肽段的原核表达与纯化

目的:利用原核系统对新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)肽段进行克隆、表达和纯化,制备高纯度的RBD肽。方法:在RBD肽段N端加入肠激酶位点序列(DDDDK),对应的核酸序列参照原核系统表达偏好进行全基因合成,构建pET-DsbC-RBD融合表达载体,通过原核表达和亲和纯化获得DsbC-RBD融合蛋白,用肠激酶对融合蛋白进行酶切和二次亲和纯化,获得高纯度新冠病毒S蛋白RBD肽。结果:构建了pET-DsbC-RBD表达载体,融合蛋白DsbC-RBD在大肠杆菌中实现了高效表达,经亲和层析纯化,重组融合蛋白DsbC-RBD相对分子质量为58×103,纯度约90%。用肠激酶对融合蛋白进行酶切,酶切效率近100%,通过二次亲和纯化获得了RBD肽,相对分子质量为25×103,纯度92%以上。结论:利用原核表达系统获得可溶性DsbC-RBD融合蛋白,采用亲和纯化和肠激酶酶切联用的方法制备获得高纯度的新冠病毒S蛋白RBD肽,为后续抗体制备和抗病毒药物筛选奠定了基础。     

糖基因Glt8d2重组蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的构建新糖基转移酶基因Glt8d2的原核表达载体,诱导融合蛋白的表达,并对其进行纯化;制备兔抗GltSd2蛋白多克隆抗体并进行鉴定。方法应用RT—PCR技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增Glt8d2目的基因片段,构建原核表达载体pET-32a（＋）-Glt8d2。转化大肠埃希菌B121,异丙基-D-半乳糖苷诱导并通过SDS—PAGE凝胶电泳分析、Western印迹分析、生物质谱分析证实Gh8d2重组蛋白表达正确。大量表达后利用Ni’亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗Gh8d2蛋白的多克隆抗体。以纯化的Glt8d2重组蛋白为抗原,分别以免疫前后的新西兰兔血清作为第一抗体,利用Western印迹和酶联免疫吸附法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测。结果扩增获得Glt8d2基因片段,成功表达了Gh8d2重组蛋白,经SDS—PAGE凝胶电泳和Western印迹分析得到证实。成功获得重组蛋白及兔抗Gh8d2多克隆抗体。ELISA检测证实多克隆抗体效价〉1：320000。免疫组织化学分析显示,该基因编码的糖基转移酶在肝实质细胞内呈胞质模式表达分布。结论利用大肠埃希菌B121能够成功表达Gh8d2重组蛋白,获得高特异性、高效价兔抗Glt8d2重组蛋白的多克隆抗体,为今后研究Glt8d2基因的生物学功能研究奠定了基础。     

抗果蝇MRJ蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

制备抗果蝇MRJ蛋白单克隆抗体可用于研究果蝇mrj的生物学功能,使用IPTG诱导重组质粒pET28a-mrj在大肠杆菌Rosetta中表达,重组蛋白经过Ni-IDA凝胶柱亲和纯化后免疫BALB/c小鼠。然后取免疫好的小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经克隆和筛选获得了能分泌抗果蝇MRJ蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。腹水制备后获得单克隆抗体,通过ELISA和Western Blot对所获得的抗体进行鉴定,结果表明所制备单克隆抗体能够特异性结合于原核及真核细胞表达的MRJ蛋白,可用于研究mrj基因的生物学功能。