TaqMan探针双重荧光定量PCR同时检测解脲支原体和巨细胞病毒

目的探讨双重荧光定量PCR技术的优化条件,建立基于TaqMan探针技术荧光定量法检测同时检测解脲支原体和巨细胞病毒的新方法。方法分别采用普通定性PCR扩增母婴垂直传播常见的病原体（解脲支原体和巨细胞病毒）测序鉴定,然后分别采用TaqMan探针的单重和双重定量PCR技术对解脲支原体和巨细胞病毒同时定性定量检测。结果解脲支原体和巨细胞病毒单种定性PCR检测均为阳性,TaqMan探针单重和双重定量PCR检测解脲支原体和巨细胞病毒阳性率和特异性均为100％,相同样品TaqMan探针单重、双重定量PCR分别检测的结果符合率100％。结论TaqMan探针双重荧光定量PCR技术可同时检测两种靶分子,结果可靠,应用前景广阔。     

囊状幼虫病病毒侵染对中华蜜蜂营养和免疫反应的影响

【目的】囊状幼虫病病毒(sacbrood virus, SBV)是严重危害中华蜜蜂Apis cerana cerana蜂群健康和种群数量的病原微生物,但其对蜜蜂的致死机制不明。本研究旨在探究SBV对不同发育阶段中华蜜蜂营养代谢和免疫的影响。【方法】分别给中华蜜蜂2日龄幼虫和新羽化成虫饲喂SBV,逐日统计死亡蜜蜂数量,检测病毒对蜜蜂存活的影响;利用qPCR检测中华蜜蜂4日龄幼虫、预蛹以及10和20日龄成虫体内SBV RNA、营养代谢基因(ilp1, ilp2, hex110, hex70b, hex70c和vg)、先天性病毒免疫基因(rel, toll, apidaecin, abaecin, defensin, hymenoptaecin, jra, key和state92e)、细胞凋亡基因(atg7和LOC100577876)和抗RNA病毒基因(dis3和dicer)的表达水平。【结果】 SBV感染显著降低了中华蜜蜂幼虫的存活率,但对成虫的生存影响不明显。SBV RNA在中华蜜蜂4日龄幼虫和预蛹体内的表达量显著高于其在10和20日龄成虫体内的表达量。SBV显著降低了中华蜜蜂幼虫营养代谢基因ilp1, ilp2, hex110, hex70b和hex70c以及成虫营养代谢基因vg和hex110的表达量,但显著提高了4日龄幼虫rel, toll, apidaecin, abaecin, defensin, hymenoptaecin和jra以及成虫key和 state92e等先天性病毒免疫基因的表达量,还引起预蛹体内的细胞凋亡基因atg7和LOC100577876的表达量显著增加。【结论】SBV在中华蜜蜂幼虫和预蛹体内的感染水平远高于在成虫体内的,其对幼虫的危害也大于对成虫。SBV显著影响了中华蜜蜂正常的营养代谢,染毒中华蜜蜂能够提高自身的免疫水平来应对;预蛹期中华蜜蜂幼虫细胞凋亡水平的显著增加可能与化蛹异常及死亡有关。     

人博卡病毒TaqMan探针实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立人博卡病毒(HBoV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码HBoV非结构蛋白NP-1的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法,并与传统PCR方法进行比较,然后分别对两者的灵敏性、特异性、稳定性及临床样本检验的适用性等进行评价。结果:所建立的实时定量PCR检测方法可用于HBoV的特异性检测;相对于传统PCR所达到的250拷贝/反应的检测灵敏度,实时定量PCR的检测灵敏度可高达10拷贝/反应,检测范围为109～101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性;初步用于76份临床呼吸道标本检测,检出阳性5例,高于普通PCR方法(3/76)。结论:建立了HBoV TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,为开展HBoV流行病学监测及早期临床诊断提供了技术手段。     

中华蜜蜂囊状幼虫病病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)单克隆抗体,本实验利用纯化的中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)免疫Balb/c小鼠,经过3次免疫后,小鼠断尾采血测其血清效价,选择效价高于1∶80 000的小鼠,在细胞融合前3~4d再加强免疫一次。取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行3次亚克隆后注射入Balb/c小鼠(Mus musculus)腹腔制备单抗腹水。共获得9株稳定分泌抗CSBV的单克隆抗体,命名为10A1、5B10、5A5、5H2、11D7、9A5、1D3、3C10、10C4,效价都在1∶16 000以上,经间接ELISA实验检测表明,具有较好的特异性。在此基础上,将9株腹水单抗分别与CSBV互作后,接种于2~3日龄中华蜜蜂幼虫,观察幼虫死亡率,研究单克隆抗体中和CSBV病毒能力,结果表明筛选到三株单克隆抗体(10A1、5A5、9A5)对CSBV有中和作用,为CSBV的防治研究奠定了基础。     

应用TaqMan荧光定量PCR检测土拉弗朗西斯菌

目的：利用Roche LightCycler实时定量PCR系统建立一种快速、灵敏、特异的检测土拉弗朗西斯菌的方法。方法：基于TaqMan荧光探针实时定量PCR技术,选择土拉弗朗西斯菌染色体上的特异序列[醇醛酮还原酶（AKR）和外膜蛋白FopA基因]作为检测靶序列,建立土拉弗朗西斯菌实时定量PCR检测方法;评价该检测方法的特异性和灵敏性;采用克隆菌株污染环境土壤来模拟实际样品,评价该检测方法在快速检测与现场检测等实际应用中的表现。结果：优化筛选基因组中的FT-AKR和FT-fopA片段作为检测靶序列,所建立的土拉弗朗西斯菌实时定量PCR检测方法检测克隆菌株质粒的灵敏度均为10个拷贝/每个反应体系;以其他非土拉弗朗西斯菌为模板未出现非特异扩增;模拟环境土壤样品检测灵敏度2个引物对分别为440和960CFU/g土壤;盲测实验结果显示对于灵敏度范围内的阳性样本均能正确识别,并能正确检测出不同浓度的阳性样本。以FT-fopA片段为靶序列的扩增效率不及基于FT-AKR引物对的扩增。结论：基于FT-AKR片段的引物对扩增效率高,检测土拉弗朗西斯菌具有特异、灵敏的特点,对临床诊断、环境污染监测、防治生物突发事件等具有重要意义。     

重庆中华蜜蜂囊状幼虫病病毒多聚蛋白基因分子特性分析

【目的】分析地处中国南方的重庆地区中华蜜蜂 Apis cerana cerana（简称“中蜂”）囊状幼虫病病毒（sacbrood virus, SBV）（AcSBV-S.Chn-CQ）的遗传特性。【方法】采用RT-PCR法对采自重庆23个区县的阳性中蜂幼虫进行SBV多聚蛋白基因扩增、序列测定和序列分析,采用邻接法（neighbor-joining method）基于基因组和基因组片段SB11-SB12构建系统进化树,使用RDP3检测SBV的基因重组。【结果】AcSBV-S.Chn-CQ与中国南方中蜂SBV（AcSBV-S.Chn）其他分离株、越南北部东方蜜蜂 A. cerana SBV（AcSBV-N.Vie）、越南北部西方蜜蜂 A. mellifera SBV（AmSBV-N.Vie）、韩国东方蜜蜂SBV（AcSBV-S.Kor）的同源性较高。AcSBV-S.Chn-CQ在结构蛋白编码区域存在连续51个核苷酸缺失,在非结构蛋白编码区域有3个不连续的核苷酸缺失,与AcSBV-N.Vie, AmSBV-N.Vie和AcSBV-S.Kor核苷酸缺失相同。AcSBV-S.Chn-CQ与AcSBV-S.Chn-FZ, AcSBV-N.Vie, AmSBV-N.Vie和AcSBV-S.Kor在亚洲基因型中形成一亚型,亚型内检测到重组事件。【结论】推测AcSBV-S.Chn-CQ与SBV-N.Vie和AcSBV-S.Kor可能来自一个共同祖先。     

中华蜜蜂和意大利蜜蜂感染囊状幼虫病毒后免疫及发育相关基因表达比较

【目的】本文旨在探究囊状幼虫病毒(sacbrood virus, SBV)对中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)和意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂幼虫发育和免疫基因、营养代谢基因、抗病毒基因、细胞发育及代谢相关基因表达的影响。【方法】从蜂群中移取2日龄的中蜂和意蜂幼虫,在培养箱(34℃, RH 85%)进行人工饲养,3日龄时接种SBV病毒,每天观察记录死亡情况,并通过实时定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测4日龄和7日龄幼虫体内SBV基因相对表达量,及免疫基因(Apidaecin、Abaecin、Hymenoptaecin、Denfensin、Lys-1、Pgrp-lc、Kenny、Domeless)、营养代谢基因(Ilp1、Hex110、Vg)、抗病毒基因(Dis3、Dicer、Ago1)、细胞组成及发育调控基因(Vhdl、Co-1-iv)以及细胞代谢和调控基因(Mta1)的表达水平。【结果】通过分析比较发现,感染相同剂量...     

TaqMan 荧光定量RT-PCR 检测犬瘟热病毒方法的建立与初步应用

犬瘟热（Canine distemper,CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）感染引起的一种急性、高度接触性、致死性传染病.CDV属副粘病毒科麻疹病毒属成员,宿主谱很广,可感染犬（Canis familiaris）、狐狸（Vulpes vulpes）、貉（Ussuriensis）、狼（Canis lupus）、雪貂（Lepus zibellina）、虎（Panthera tigris）、狮（Panthera leo）、大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）、小熊猫（Ailures fulgens）、黑熊（Selenarctas thibetanus）等动物,严重危害养犬业、经济动物养殖业的健康发展以及野生动物的生存.     

人多瘤病毒7 TaqMan探针实时定量PCR检测方法的建立

目的:建立人多瘤病毒7(HPy V7)核酸快速、特异的Taq Man探针实时定量PCR检测方法。方法:分别设计HPy V7特异性的引物与Taq Man探针,建立实时荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏性和重复性进行评价;用建立的方法检测200份健康成人志愿者的血清和300份急性呼吸道感染住院儿童的鼻咽抽吸物样本。结果:所建立的实时定量PCR方法对HPy V7的检测灵敏度可达10拷贝/μL,检测线性范围为101~1010拷贝/μL,且实验特异性和重复性好(CV1.0%);采用该方法,从200份血清样本中检出9份阳性标本。结论:建立了HPy V7 Taq Man探针实时定量PCR检测方法,为HPy V7的流行病学调查及其初步研究提供了技术手段。     

烟草环斑病毒的定量检测技术研究

目的:建立特异、灵敏、快速的TaqMam实时荧光定量PCR方法,用于烟草环斑病毒(TRSV)的定量检测。方法:用纳米磁珠法提取病毒RNA,构建包含烟草环斑病毒全CP序列的质粒标准品。根据CP保守序列设计特异性的引物和TaqMam荧光探针,构建标准曲线,建立TRSV的实时荧光绝对定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:建立的方法特异性好,与南芥菜花叶病毒、马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒均无交叉反应;至少能检测到767个病毒拷贝,灵敏度比普通PCR高100倍;同一样品试验内及试验间重复性实验的变异系数均小于3%,重复性好;检测结果准确可靠,构建的标准曲线有较好的线性关系(R2=0.997)。结论:建立的TRSV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法可满足口岸高通量、快速、准确的检验检疫要求。     

产气荚膜梭菌实时荧光PCR方法的建立

目的:利用荧光定量PCR技术,建立快速敏感特异的检测产气荚膜梭菌的方法。方法:以产气荚膜梭菌基因为靶序列设计引物和探针,以自产气荚膜梭菌菌株中提取的DNA为模板,优化引物和探针的浓度比,同时验证方法的特异性、敏感性。结果:建立的反应体系在上游引物浓度为0.45μmol/L、下游引物浓度为0.15μmol/L、探针浓度为0.3μmol/L时,具有良好的特异性和敏感性,与创伤弧菌等12种相关细菌均无交叉反应;对纯菌检测的灵敏度低于10 CFU/反应体系。结论:建立的实时荧光PCR方法特异、灵敏、快速,能对战时气性坏疽做出快速准确的报告,实现对这种战时高发疾病的安全、快速和定量检测。     

Detection of Minute Virus of Mice Using Real Time Quantitative PCR in Assessment of Virus Clearance During the Purification Of Mammalian Cell Substrate Derived Biotherapeutics

A real time quantitative PCR assay has been developed for detecting minute virus of mice (MVM). This assay directly quantifies PCR product by monitoring the increase of fluorescence intensity emitted during enzymatic hydrolysis of an oligonucleotide probe labelled covalently with fluorescent reporting and quenching dyes via Taq polymerase 5'-->3' exonuclease activity. The quantity of MVM DNA molecules in the samples was determined using a known amount of MVM standard control DNA fragment cloned into a plasmid (pCR-MVM). We have demonstrated that MVM TaqMan PCR assay is approximately 1000-fold more sensitive than the microplate infectivity assay with the lowest detection limit of approximately one particle per reaction. The reliable detection range is within 100 to 10(9) molecules per reaction with high reproducibility. The intra assay variation is <2.5%, and the inter assays variation is <6.5% when samples contain >100 particles/assay. When we applied the TaqMan PCR to MVM clearance studies done by column chromatography or normal flow viral filtration, we found that the virus removal factors were similar to that of virus infectivity assay. It takes about a day to complete entire assay processes, thus, the TaqMan PCR assay is at least 10-fold faster than the infectivity assay. Therefore, we concluded that this fast, specific, sensitive, and robust assay could replace the infectivity assay for virus clearance evaluation.     

呼吸道合胞病毒TaqMan探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的:建立呼吸道合胞病毒(RSV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码RSV非编码蛋白的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并与传统RT-PCR方法进行比较,分别对两者的灵敏性、特异性、重复性及临床样本检验的适用性进行评价。结果:所建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于RSV的特异性检测。相对于传统RT-PCR方法100拷贝/反应的检测灵敏度,实时荧光定量RT-PCR的检测灵敏度达到10拷贝/反应,检测范围为1010~101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性。从169份临床呼吸道标本中检出RSV阳性40例,高于普通PCR方法(31/169)。结论:建立了RSV的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,在临床上具有较好的应用前景。     

李痘病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的:建立李痘病毒(PPV)特异、灵敏、快速的实时荧光定量RT-PCR检测方法,用于核果类种苗的健康评测及李痘病毒疫情监测。方法:根据PPV-D株系和PPV-M株系的外被蛋白(CP)基因保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,扩增全长CP基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体上,构建质粒标准品,建立PPV的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:此荧光定量RT-PCR方法对PPV检测呈现高灵敏度和高特异性,与马铃薯Y病毒和马铃薯X病毒无交叉反应,最低检出限可达1.6×102拷贝/μL,标准曲线的相关系数为0.999 18。结论:建立了李痘病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,可望应用于检验检疫部门对李痘病毒的快速检测。     

嗜肺军团菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的：建立针对嗜肺军团菌Mip基因的实时荧光定量TaqMan PCR检测方法,并进行自来水和空调冷却水模拟标本的检测评价。方法：根据嗜肺军团菌Mip基因的特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立嗜肺军团菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法,对方法进行灵敏度及特异性评价,并对自来水和空调冷却水模拟标本中的嗜肺军团菌进行检测。结果：建立的方法对嗜肺军团菌的检测具有高度特异性,与3种非嗜肺军团菌和6种其他呼吸道病原均没有交叉反应;基因组DNA的检测灵敏度为1.6pg／μL,模拟自来水和空调冷却水标本的检测灵敏度为10CFU／mL。结论：建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,适于嗜肺军团菌的日常监测和暴发疫情的应急诊断。     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。