一株金黄色葡萄球菌噬菌体的裂解谱特异性和分子分类研究

[目的] 从医院污水中分离金黄色葡萄球菌噬菌体,观察其形态,确证裂解谱特征并研究生物学和基因学特性,为噬菌体的临床应用奠定实验基础。[方法] 将金黄色葡萄球菌ATCC25923作为宿主菌,采用双层琼脂平板法从医院污水中分离纯化噬菌体,电镜下观察形态并测定其最佳感染复数、一步生长曲线及裂解谱;全基因组测序并进行基因结构分析和功能注释。[结果] 从4份医院污水中共分离到1株金黄色葡萄球菌噬菌体（命名为vB_SauH_SAP1）,仅裂解10株临床分离的葡萄球菌属受试菌（共计37株）,其余74株其他种属菌株不能被裂解;透射电镜观察具有正20面体头部和收缩性尾部,属于肌尾噬菌体;其最佳感染复数为0.1,潜伏期10 min,裂解期为20 min。vB_SauH_SAP1基因组全长143375 bp,G+C含量为30.2%,编码226个开放阅读框（ORF）,未发现已知的毒力相关基因和抗生素抗性基因,基因组与Kayvirus属葡萄球菌噬菌体有较高的同源性。[结论] 分离到1株新的Kayvirus属金黄色葡萄球菌噬菌体,根据生物学特性和基因组研究,具有一定的潜在应用价值。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP4的分离与鉴定

[目的]鉴定一株新分离的铜绿假单胞菌噬菌体PaP4的生物学特性.[方法]双层琼脂培养法制备PaP4的单个噬斑,观察噬斑特点;用聚乙二醇8000浓缩PaP4颗粒后,再用氯化铯密度梯度离心纯化;用透射电子显微镜观察磷钨酸负染色的PaP4颗粒;提取PaP4基因组核酸,通过限制性内切酶图谱分析其核酸类型;按照感染复数(MOI)分别为0.000 1、0.001、0.01、0.1、1和10加入噬菌体纯培养液和宿主菌,充分裂解细菌后,测定噬菌体滴度;以MOI=10的比例加入噬菌体及宿主菌,进行一步生长实验,绘制一步生长曲线.[结果]PaP4的噬斑直径约3 mm-5 mm,圆形透明边缘清晰;PaP4噬菌体呈多面体立体对称的头部,直径约50 nm,有一个约30 nm的短尾;限制性酶切实验表明PaP4基因组为双链DNA;当MOI为0.001时PaP4感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高;用一步生长曲线描绘了其生长特性.[结论]PaP4属dsDNA短尾科裂解性噬菌体;最佳感染复数是0.001;由一步生长曲线得出感染宿主菌的潜伏期是25 min,裂解期是20 min,平均裂解量是150.     

阪崎肠杆菌噬菌体的分离及其生物学特性

[目的]以阪崎肠杆菌模式菌株及分离菌株为指示菌,从污水中分离出该菌噬菌体,并对其基本生物学特性进行研究.[方法]以双层琼脂法从污水中分离噬菌体,通过同属和同科参考菌株测定噬菌体的特异性和宿主谱;电镜观察噬菌体颗粒形态;随机扩增多态性DNA(RAPD)实验分析噬菌体的分子生物学特性.[结果]从污水中分离得到5株噬菌体,表现出较窄的宿主范围,仅裂解阪崎肠杆菌,以ATCC 51329分离的噬菌体SK2可裂解27株阪崎肠杆菌中的24株(89%),负染经电镜观察,5株噬菌体都是由多面体头部和尾部组成;随机引物(5′-GAAACGGGTG-3′)扩增DNA分析,5株噬菌体DNA明显不同.[结论]分离出的5株噬菌体仅对阪崎肠杆菌敏感,在阪崎肠杆菌的分型、预防、治疗、以及生态环境的净化等方面具有潜在用途.     

两株新的金黄色葡萄球菌烈性噬菌体的生物学特性和基因组学研究

以金黄色葡萄球菌为宿主菌,从奶牛场废水样品中分离到两株烈性噬菌体,分别命名为phiSA_BS1和phiSA_BS2。电子显微镜观察显示其头部呈多面体对称,有伸缩性尾部。对这两株噬菌体的一步生长曲线、温度耐受性和pH耐受性进行研究,发现两者均裂解3株金黄色葡萄球菌,但不能裂解1株表皮葡萄球菌。进一步分析它们的全基因组序列,发现phiSA_BS1基因组大小为 142 978 bp,GC含量为 29.80%,预测到201个开放读码框(open reading frame,ORF),未预测到tRNA基因;phiSA_BS2基因组大小为 149 230 bp,GC含量为 29.61%,预测到210个ORF和1个tRNA基因。系统发育分析表明,这两株噬菌体同属肌尾噬菌体科,属于新的金黄色葡萄球菌噬菌体,可能为治疗金黄色葡萄球菌相关的奶牛乳腺炎提供新的方法。     

一株感染铜绿假单胞菌的双链RNA噬菌体PaP6的分离和鉴定

【目的】鉴定一株新分离的铜绿假单胞菌噬菌体PaP6的生物学特性。【方法】利用铜绿假单胞菌临床分离株PA038为宿主,从西南医院污水中分离得到一株裂解性噬菌体PaP6,观察其噬斑特点;氯化铯密度梯度离心纯化噬菌体颗粒后,用透射电子显微镜观察噬菌体形态;提取PaP6基因组,通过DNA酶和RNA酶酶切,做基因组酶切图谱分析;按照感染复数(MOI)分别为10、1、0.1、0.01、0.001和0.000 1加入噬菌体和宿主菌,裂解细菌后,测定噬菌体滴度;以MOI=10的比例加入噬菌体和宿主菌,绘制一步生长曲线;用112株铜绿假单胞菌临床分离株检测PaP6宿主谱。【结果】PaP6的噬斑直径约2 mm-4 mm,圆形透明,边缘清晰;PaP6噬菌体呈多面体立体对称的头部,直径约45 nm;酶切图谱表明PaP6基因组对DNase不敏感,对RNase敏感,未酶切基因组具有3节段双链RNA(dsRNA),长度分别约为9.0、4.5、3.5 kb,共约17 kb;当MOI为0.1时PaP6感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高,达到3.4×109 PFU/m L;用一步生长曲线描绘了其生长特性;PaP6可以感染40.1%的临床分离株,是一株比较广谱的噬菌体。【结论】首次报道了一株铜绿假单胞菌的ds RNA分节段噬菌体,分类学上属于囊病毒科,该噬菌体具有较广的宿主谱,在噬菌体治疗领域具有应用前景。     

一株新型旱獭源性宽谱大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及基因组分析

[目的]分离喜马拉雅旱獭肠内容物样本中的噬菌体,并研究其生物学特性和基因组特征。[方法]以大肠杆菌为宿主菌,利用双层琼脂平板法从喜马拉雅旱獭肠内容物样本中分离噬菌体;用透射电镜观察形态特征;测定其最佳感染复数、一步生长曲线、酸碱耐受度及宿主裂解谱等生物学特性,并进行全基因组测序。[结果]从喜马拉雅旱獭肠内容物样本中分离得到一株裂解性大肠杆菌噬菌体,命名为vB_EcoM_TH18,其噬菌斑呈无晕环的透亮圆形,透射电镜观察发现该噬菌体头部直径为(90±5) nm,尾部长度为(115±5) nm;最佳感染复数为1;一步生长曲线显示其潜伏期为10 min,110 min后进入平台期,平均裂解量为15 PFU/mL;在pH 4.5-9.5的范围内具有稳定活性;可裂解多种致病型和血清型大肠杆菌和宋内志贺氏菌,无法裂解沙门氏菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌及鲍曼不动杆菌;基因组测序结果表明,其基因组长度为133 882 bp,GC含量为39.95%。基因组共注释到210个编码序列(CDS)和13个tRNAs,不含毒力基因及耐药基因。BLASTn比对结果表明该基因组与Avunavirus属噬菌体Av-05同源性为95.17%。基于噬菌体全基因组、主要衣壳蛋白和终止酶大亚基分别构建系统进化树,结果表明vB_EcoM_TH18是一株肌尾噬菌体科(Myoviridae) Avunavirus属的新型噬菌体。[结论]从喜马拉雅旱獭肠内容物中成功分离并鉴定了一株新型宽谱大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_TH18,可裂解多种致病型和血清型的大肠杆菌及宋内志贺菌。     

一株金黄色葡萄球菌噬菌体的分离鉴定与生物学特性

【背景】金黄色葡萄球菌作为一种条件致病菌,在临床感染中扮演着重要的角色,需要研究更多更有效的防治手段。【目的】分离金黄色葡萄球菌噬菌体,研究其生物学特性,从而为金黄色葡萄球菌的替代防治提供理论借鉴。【方法】以金黄色葡萄球菌D085为宿主从污水中分离得到一株噬菌体,命名为v B_Sau S_SAP3,用PEG8000浓缩、氯化铯密度梯度离心获得高纯度的噬菌体,1%乙酸双氧铀染色噬菌体进行电镜观察。测定噬菌体宿主谱、最佳感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)、一步生长曲线、热稳定性、pH值稳定性及有机溶剂对噬菌体活性的影响。平衡酚法获取噬菌体基因组,Illumina测序技术和SPAdes软件进行基因组测序分析。【结果】电镜下,噬菌体SAP3头部直径为60±5 nm,尾部长170±5 nm。噬菌体vB_SauS_SAP3还能裂解5株金黄色葡萄球菌和1株产色葡萄球菌,其最佳感染复数为0.1。噬菌体vB_SauS_SAP3潜伏期为20 min,60 min后进入平台期,裂解量约为210 PFU/cell;对45°C以下温度有一定耐受性,超过45°C开始急剧失活;能在中性pH值时保持稳定活性,酸性环境会使其急剧失活,对碱性环境有一定的抵抗力;对氯仿和异戊醇不耐受。其基因组分析结果表明:噬菌体基因组大小为41950bp,GC含量为35.42%,预测有65个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。进化分析表明,噬菌体vB_SauS_SAP3属于长尾科噬菌体,是一种新型的噬菌体。【结论】噬菌体vB_SauS_SAP3是一株窄谱的能够耐受一定温度和碱性环境的长尾科新型噬菌体,对其研究可为金黄色葡萄球菌噬菌体的研究提供理论材料。     

噬菌体ΦEc-SL25对大肠埃希菌临床分离株裂解作用的研究

目的分离鉴定大肠埃希菌噬菌体并分析其裂解特性,为噬菌体疗法应用于大肠埃希菌感染提供实验依据。方法采用双层琼脂噬斑法从污水中分离噬菌体,通过透射电镜观察噬菌体的形态学特征,利用限制性酶切图谱初步分析噬菌体的基因组,测定噬菌体对宿主菌的最佳感染复数和一步生长曲线,分析噬菌体对宿主菌的裂解谱,观察噬菌体在不同的pH及温度下对宿主菌的裂解特性,SDS-PAGE分析噬菌体的主要和次要蛋白。结果通过噬斑法从污水中分离出1株能裂解大肠埃希菌的噬菌体,命名为ΦEc-SL25;电镜显示,噬菌体ΦEc-SL25的形态特征符合有尾病毒目、管尾病毒科噬菌体;ΦEc-SL25的最佳感染复数为0.01;一步生长曲线表明,噬菌体ΦEc-SL25的潜伏期为5 min,爆发期为10 min;ΦEc-SL25对26株大肠埃希菌的裂解率可达30.8%;在温度70℃20min时以及在pH 4~10的范围内,噬菌体ΦEc-SL25仍保持其裂解活性;蛋白电泳可观察到2条主要蛋白带和至少3条次要蛋白。结论噬菌体ΦEc-SL25是一种潜伏期短、裂解较性强的毒性噬菌体,可用于开发针对大肠埃希菌感染的生物制剂。     

EAEC噬菌体PNJ1809-11和PNJ1809-13作为环境消毒剂的杀菌效果评估

[目的] 分析2株肠聚集性大肠杆菌（EAEC） CVCC232噬菌体PNJ1809-11、PNJ1809-13的生物学特性,并对其作为环境消毒剂的杀菌效果进行评估。[方法] 透射电镜下观察PNJ1809-11、PNJ1809-13的形态;通过宿主谱、最佳感染复数（MOI）、一步生长曲线、对pH和温度耐受性的测定分析PNJ1809-11、PNJ1809-13的生物学特性;比较2株噬菌体的体外杀菌效果和喷雾、雾化处理后的杀菌效果;检测噬菌体在模拟养殖环境下的耐受性,及喷雾处理的噬菌体制剂在模拟养殖环境下的杀菌效果和对宿主菌生物被膜的清除效果;分析宿主菌的抗性突变率。[结果] 电镜下观察PNJ1809-11、PNJ1809-13均为肌尾病毒科噬菌体;PNJ1809-11可裂解155株大肠杆菌,PNJ1809-13可裂解46株大肠杆菌;噬菌体PNJ1809-11、PNJ1809-13的最佳感染复数（MOI）均为10,最适pH均为7;与PNJ1809-13相比,PNJ1809-11具有较好的热稳定性;在模拟的封闭装置中,将两株噬菌体分别经喷雾、雾化处理后,二者对宿主菌的杀灭效果均可达99%以上;对人工污染的粪便表面细菌的杀灭效果均达到99%以上。噬菌体PNJ1809-11、PNJ1809-13及两者的混合制剂（噬菌体鸡尾酒）对宿主菌CVCC232形成的生物被膜的裂解效率分别为78%、30%和83%。噬菌体PNJ1809-11在养殖温度、粪便pH以及阳光照射下,其耐受性均强于PNJ1809-13。宿主菌对PNJ1809-11、PNJ1809-13的抗性突变率分别为2.5×10^–3和1.0×10^–3。[结论] 综上,噬菌体PNJ1809-11的环境耐受力更强,噬菌体鸡尾酒对生物被膜的裂解效果更好,提示噬菌体PNJ1809-13或噬菌体鸡尾酒经喷雾处理后具有作为环境杀菌剂的潜力。     

一株可裂解动物源性多重耐药志贺氏菌的噬菌体分离鉴定及其生物学特性研究

从鸡的肠道内分离鉴定多重耐药志贺氏菌(Shigelle)，纯化获得可侵袭、裂解该志贺氏菌的噬菌体，并研究其生物学特性。以养殖场病鸡肠道中分离的志贺氏病原菌为宿主，筛选鉴定噬菌体，聚乙二醇沉淀浓缩噬菌体，通过透射电镜观察噬菌体形态，双层平板法测定噬菌体宿主谱、最佳感染复数、一步生长曲线、酸碱耐受性和热稳定性，测定噬菌体对多重耐药致病性志贺氏菌的裂解效果。通过上述方法，共筛选到26株志贺氏菌分离株，分别命名为BS1~BS26。以志贺氏菌BS26为宿主菌分离得到一株裂解性噬菌体并命名为噬菌体PSF26，鉴定为有尾噬菌体目，长尾噬菌体科，噬菌体对福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）和宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)分离株均有裂解作用。噬菌体PSF26的最佳感染复数为0.1，感染周期为90 min，包括75 min的潜伏期和15 min的爆发期，裂解量为(58±17) pfu/cell。噬菌体PSF26在pH 5~8，温度0~40 ℃条件下能保持较高活性，对宿主菌的抑菌圈直径为(11.33±1.53) mm。结果表明，噬菌体PSF26爆发期短，裂解量高，有较好的酸碱、温度耐受性，对多重耐药性福氏和宋内志贺氏菌有良好的作用效果，为利用噬菌体防控饲养动物中食源性致病菌感染和饲用抗生素替代技术研发提供参考。