人外周血单核细胞的分离和电穿孔法转染

目的:建立分离纯化人外周血单核细胞及转染的有效方法。方法:应用基于HISTOPAQUE的密度梯度离心及抗体标记纯化的方法分离单核细胞,并以电穿孔技术转染绿色荧光蛋白(GFP)表达质粒、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)小干扰RNA。结果:基于外周血单核细胞的表面标志分子CD14的流式细胞分析表明得到了高纯度(89.95%)的外周血单核细胞;GFP荧光照片显示GFP表达质粒的转染效率为60%～70%;免疫印迹显示TRAF6的表达抑制(90%)下调了脂多糖(LPS)对JNK的激活,说明通过电穿孔技术有效递送了TRAF6小干扰RNA,表明单核细胞若缺少TRAF6将抑制LPS-TLR4信号通路的激活。结论:建立了一种高效的从人外周血中分离原代单核细胞的方法,且应用基于NucleoFectorⅡ的电穿孔技术实现了对此原代单核细胞的高效转染,为进一步外周血单核细胞的相关功能研究奠定了方法学基础。     

Nogo-B与Clusterin结合对细胞凋亡的影响

神经轴突生长抑制因子Nogo—B在体分布广泛,提示其除了具有抑制中枢神经系统轴突再生作用外,可能还扮演其他重要的功能角色。该研究为探讨Nogo-B下游新的结合分子及其功能开展相应研究。通过设计诱饵蛋白筛选人脑cDNA文库、免疫共沉淀方法,寻找Nogo-B下游结合分子：通过流式细胞术,检测结合对于细胞凋亡的影响：通过绿色荧光蛋白标记和免疫组织化学方法,探讨Nogo-B诱导细胞凋亡的机制。结果提示,Clusterin除了与Nogo-66功能域在酵母双杂交系统中存在结合,与Nogo—B在哺乳细胞中也能发生结合。过表达Nogo-B可明显诱导HEK293细胞凋亡,与Clusterin共表达可下调早期细胞凋亡率,但后期Nogo—B可通过调节Clusterin由胞浆到胞核转位,进一步诱导细胞凋亡进程。该研究首次提出Nogo—B与Clusterin之间存在结合,且结合参与了Nogo-B诱导的细胞凋亡进程。     

鹅圆环病毒感染性克隆的构建及其转染试验

设计带BamHⅠ酶切标记位点的引物,PCR扩增鹅圆环病毒(Goose circovirus,GoCV)全长基因组,将2个基因组顺式连接插入到pGEM-T Easy载体中,获得GoCV全长基因组头尾串联二聚体感染性克隆质粒pGEMT-2GoCV。EcoRⅠ酶切线性化pGEMT-2GoCV,与脂质体混合转染GoCV阴性鹅胚和雏鹅,常规PCR检测发现GoCV在转染鹅体内增殖,鹅胚转染组于孵出第2周和第4周检出血清阳性,且其中一个个体于4周龄扑杀时检出法氏囊阳性,雏鹅转染组于转染后2周检出血清阳性。试验进一步对扩增片段进行了BamHⅠ标记位点的检测,并应用GoCV实时荧光定量PCR方法对转染阳性样品进行了定量,结果显示阳性法氏囊组织中病毒含量为1.57×106拷贝/mg,阳性血清含病毒拷贝数在3.52×104～5.92×105拷贝/μL。综上,本试验构建的GoCV全长基因组头尾串联二聚体感染性克隆DNA可以转染鹅胚和雏鹅并增殖出带标记的GoCV克隆。     

新型聚乙烯亚胺衍生物在Hep G2 细胞中转染和毒性的研究

目的:研究以对苯二甲醛( Terephthalaldehyde)为连接剂的聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)衍生物PEI-Tp对肝癌细胞Hep G2的转染活性和细胞毒性的影响.方法:以荧光素酶质粒作为报告基因,研究高分子和DNA的复合物在Hep G2细胞中的转染活性,用MTT的方法研究高分子对Hep G2细胞的毒性.结果:Hep G2细胞转染结果显示构建的聚乙烯亚胺衍生物PEI-Tp具有高效输送质粒的能力;细胞毒性结果显示PEI-Tp随着浓度的增加,其毒性显著低于PEI25 kDa.结论:Hep G2细胞实验数据显示PEI-Tp是一种高效、低毒,在基因治疗领域有相当前景的非病毒载体.     

白细胞介素-21与乙型肝炎病毒前S2S抗原融合蛋白在293T细胞中的表达

目的:构建白细胞介素-21(interleukin-21,IL-21)和乙型肝炎病毒前S2S抗原(S2S)的融合表达质粒,并研究其在293T细胞中的表达。方法:采用PCR方法扩增IL-21和HBV前S2S基因片段,分别克隆入pcDNA3真核表达质粒,用分子克隆方法构建融合表达质粒,并以脂质体2000转染293T细胞,分别应用ELISA法和Western Blot法检测细胞上清及细胞中IL-21和HBsAg的表达水平。结果:经酶切鉴定及DNA序列证实重组质粒内插入片段序列正确,三种重组质粒分别命名为pcDNA-IL-21、pcDNA-S2S和pcDNA-IL-21-S2S,并且重组质粒能在293T细胞内表达并分泌相关蛋白。结论:成功构建IL-21和乙型肝炎病毒前S2S抗原的融合表达质粒,重组质粒能在真核细胞内表达。     

聚(L-赖氨酸)及其嵌段聚物的基因转染性能研究

聚左旋赖氨酸(poly(L-lysine))可以作为基于载体应用于基于转染。但由于DNA转染效率较低,现在对于聚左旋赖氨酸的研究更多的集中在对于其修饰上。本实验是在前人的基础上对已合成的PLLz和mPEG-PLLz进行脱保护,得到了重复单元为80、100、120的PLL,mPEG-PLL,对得到的材料进行了细胞毒性,荧光素梅转染定性以及定量的实验。分析得出结论相同重复单元的mPEG-PLL的转染效率要高于PLL。     

7型腺病毒E1A基因克隆及真核表达

为了研究7型腺病毒(Ad7)E1A在感染中的致病机制,分离了Ad7d2病毒株,构建了Ad7 E1A基因的真核表达体系.用A549细胞分离培养痰液标本中的腺病毒,应用重叠延伸PCR扩增Ad7 E1A基因外显子,产物克隆至真核表达载体pIRES-Neo,构建重组子pIRES-Neo-Ad7E1A并转染A549细胞,利用Western印迹对其表达产物进行鉴定.克隆测序显示扩增的Ad7 E1A基因外显子包含了完整的编码区基因,pIRES-Neo-Ad7E1A转染A549细胞的表达产物经Western印迹鉴定与设计相符.成功建立了Ad7 E1A 基因的真核表达体系.     

BTV及其dsRNA分子诱导IFN产生和细胞凋亡

在离体培养细胞上探讨BTV(BluetongueVirus,BTV)和BTVdsRNA分子诱导人宫颈癌Hela细胞IFN(Interferon)产生和凋亡的生物医学作用。离体培养的人宫颈癌Hela细胞单层分别施以不同水平的蓝舌病毒(BTV)和脂质体包裹的BTVdsRNA等因素处理,比较研究不同处理后细胞形态学差异;并通过MTT法检测不同处理条件下细胞存活率的差异;ELISA试剂盒检测培养细胞上清液中IFN含量及流式细胞仪检测细胞凋亡率。分析了不同处理条件下不同用量的病毒及不同浓度的RNA脂质体复合物诱导培养细胞产生IFN量的差异,揭示了不同因素和不同水平处理下,Hela细胞IFN产量具有显著性差异(p<0.05),而BTVdsRNA诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡能力低于BTV(p<0.05)。BTVdsRNA可显著诱导人宫颈癌细胞产生IFN和凋亡,推断BTVdsRNA具有发展成为新的干扰素诱导剂的潜能。     

一个用于转染细胞分选的双顺反子载体的构建及其应用

为简化转染细胞的分选过程,构建了一个含有细胞表面标志 CD34 基因的双顺反子载体 p3.1-IRES-CD34. 利用来源于脑心肌炎病毒 (EMCV) 的内部核糖体进入位点 (IRES) ,实现目的基因与 CD34 基因的共同表达 . 将绿色荧光蛋白 (EGFP) 作为目的基因插入载体的多克隆位点,然后转染 NIH-3T3 细胞,通过免疫磁珠分选 (MACS) 方法来分选细胞 . 结果表明：对于转染细胞,均可实现快速分选 ( 瞬时转染细胞约 48 h ,稳定转染 10~15 天 ) ,并且获得较高纯度 (95% 以上 ) 的表达目的基因细胞 .     

无饲养层培养人胚胎干细胞方法的建立

人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hES细胞)是当前医学研究的热点之一．然而hES细胞培养条件苛刻,通常需要采用鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEFs)饲养层来维持其未分化状态,成为目前hES细胞研究的瓶颈之一、本实验成功地将hES细胞接种在细胞外基质包被的六孔板上培养,传代20次后细胞仍然保持良好的未分化状态,各种hES细胞生物学特性(如表面标志物SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-8l,OCT-4,碱性磷酸酶及体内外分化潜能等)均无改变;其冻存、复苏效果与生长在饲养层上的hES细胞无明显差异．因此,该无饲养层培养体系可以用于培养hES细胞,并为hES细胞转基因研究及大规模培养打下良好的基础．