慢病毒载体的构建及其介导的绿色荧光蛋白在胰岛β细胞中的表达

目的 获得能够在大鼠胰岛β细胞中高效表达的慢病毒载体。方法 以PCR的方法扩增绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）片段,并将其通过穿梭质粒装入pLenti6／V5表达质粒,然后用脂质体转染试剂将plenti6／V5 GFP、pLP1、pLP2以及pLP／VSVG转染入293FT细胞,获得的病毒用人纤维瘤细胞系的HTl080细胞进行滴定。然后用一定滴度的慢病毒转导大鼠胰岛β细胞系INS-1,观察转导效率。结果 通过限制性内切酶和琼脂糖凝胶电泳方法,观察到所克隆入pLenti6／V5表达质粒的GFP片段大小正好与PCR扩增出的片段一致。经测序验证,序列与NCBI网站上GFP序列完全一致。转染结果显示,经293FT细胞所产生的慢病毒,转导效率达到80％以上。而在1×10^6／ml病毒颗粒的情况下,AAV—GFP病毒几乎不能转导β细胞。结论 与同一滴度的AAV—GFP病毒相比,胰岛β细胞的转导效率有非常显著的差异。即慢病毒载体表达系统在对胰岛β细胞转导的能力上,明显优于重组腺辅病毒表达系统。表明慢病毒载体在糖尿病基因治疗中,特别是对胰岛β细胞的转基因工作中,有着良好的应用前景。     

用于哺乳动物细胞转染的高纯度质粒DNA的制备

目的：建立简便高效、成本低廉和安全无污染的高纯度质粒提取方法。方法：在乙酸铵方法的基础上加以改进,主要改进之处在于增加了用聚乙二醇纯化质粒的步骤,并对溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的成分和具体实验参数也做了合理的改进,以最少的步骤,充分去除了残存杂质,保证了质粒的超纯状态。结果：用本方法提取的质粒与用QIAGEN plasmid midi Kit提取的质粒在理化指标上没有差别,对哺乳动物胞具有同样的转染效率。结论：本方法可完全取代QIAGEN公司的试剂盒用于提取超纯质粒。     

一种可降解的阳离子聚合物基因转染试剂

目的：合成一种高效、低毒的新型阳离子聚合物载体。方法：以低分子量的聚乙烯亚胺（PEI）为阳离子聚合物的基本单位,以可水解的2,4-戊二醇二丙烯酸盐（PODOA）为交联剂,合成高分子聚合物。用DNA凝胶迟滞实验验证聚合物与DNA的亲和力,以绿色荧光蛋白基因和萤光素酶检测其基因转染效率,用聚合物凝胶电泳实验鉴定其降解性,以MTT法检测其细胞毒性。结果：聚合物具有高的DNA结合亲和力、高基因转染效率,基因转染后的萤光素酶活性高达3×10^9RLU／mg,其基因转染效率相当于甚至优于目前市售的转染试剂,而细胞毒性明显低于其他试剂。该聚合物在中性环境下可降解,而在酸性条件下非常稳定。结论：合成的聚合物具有高转染效率和低细胞毒性,可能在转染和基因治疗研究中起重要作用。     

基因枪技术及其在基因治疗中的应用进展

目前基因转染载体主要分为病毒型载体和非病毒型载体,病毒载体虽转染率较高、表达时间长,但其安全性令人担忧,非病毒载体中基因枪的优势最为明显,临床化趋势最强。通过分析非病毒基因转染技术面临的障碍,介绍了基因枪技术的产生和原理及其显著的优势,并总结了当前基因枪技术在基因治疗中的应用,指出了基因枪技术发展面临的问题和发展方向。     

MEKK3稳定表达细胞株的建立及其对A549细胞增殖的影响

目的 构建人MEKK3基因编码区序列（cDNA）的真核表达载体、建立其稳定表达细胞株并观察其对肺腺癌细胞增殖的影响.方法 从A549细胞中提取总RNA,应用RT-PCR扩增MEKK3 cDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/hygro（＋）质粒中,构建成MEKK3基因的真核表达载体,然后转染入人肺腺癌A549细胞中,潮霉素筛选稳定转染克隆,通过MTT实验,研究转染MEKK3基因前后细胞增殖的变化.结果 重组载体经酶切鉴定和测序证实目的 基因正确无误,Western印迹检测结果显示MEKK3基因在A549细胞中具有良好的表达;荧光实时定量PCR结果表明MEKK3基因在其稳定转染的A549细胞克隆中表达上调,与空载体稳定转染及未转染细胞比较,差异具有统计学意义（P＜0.05）;MTT结果显示MEKK3表达上调的稳定克隆组,A549细胞的增殖活性显著增强（A570=0.876 1±0.074 5）,明显高于空载体稳定转染组（A570=0.582 8±0.070 3）及未转染亲代细胞组（A570=0.584 9±0.035 2）,差异具有统计学意义（P＜0.01）,而后两者之间差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 MEKK3表达上调可导致肺腺癌细胞的增殖增强.     

半乳糖配体介导大鼠白介素10基因在大鼠肝脏内的靶向表达

目的 探讨大鼠白介素10（rIL-10）基因是否可通过半乳糖配体介导的脂质体转染法在大鼠肝脏内靶向表达。方法将已构建好的rIL-10基因真核表达质粒与半乳糖配体转染试剂按jetPEI．Gal／DNA（N／P=10）比例混合,通过尾静脉注射转移至大鼠体内。RT—PCR法和ELISA法检测rIL-10基因转移至体内0h、24h、7d和16d后大鼠肝、肾、脾和肺组织及血清中rIL-10的表达情况。结果rIL-10基因转移前大鼠肝、肾、脾和肺组织末扩增出明显rIL-10mRNA表达,转移7d后rIL-10表达主要分布在肝组织。肝组织中rIL-10mRNA表达在基因转移24h和7d时显著升高。血清中的rIL-10浓度在转移后24h和7d浓度分别为（107．92±12．26）pg／ml和（33．2±13．15）pg／ml。结论rIL-10基因通过半乳糖配体介导的脂质体转染法可有效的转移至大鼠体内,并可在肝脏靶向表达一周左右时间。     

过表达外源ST3Gal I增加MCF-7细胞与胞外基质粘附和侵袭能力

为探讨过表达外源α2,3-唾液酸转移酶（ST3Gal Ⅰ）对乳腺癌MCF-7细胞粘 附和侵袭能力的影响,构建pEGFP-N1-ST3Gal I真核表达载体.采用GenEscortTM Ⅱ包裹后转染MCF-7细胞. MCF-7细胞为3组：未转染组 (M)、转染空质粒组 (P) 和转染ST3Gal I组 (ST3); 荧光显微镜观察融合蛋白EGFP ST3Gal I的表达.采用 半定量RT-PCR、Western印迹法分析转染后MCF-7细胞ST3Gal Ⅰ基因mRNA水平和 蛋白表达水平;流式细胞术分析ST3Gal Ⅰ下游产物细胞表面α2,3-唾液酸含量;采用细胞粘附实验及transwell小室检测转染前后细胞与基质胶Matrigel粘附、迁移和侵袭运动能力的变化.结果表明, 荧光显微镜下P组细胞内绿色荧光呈弥散分 布,而ST3组绿色荧光主要集中在细胞质中,RT-PCR与Western印迹也证实了外源 ST3Gal Ⅰ基因mRNA和蛋白表达均明显增加（P<0.05）,其下游产物细胞表面 α2,3-唾液酸含量明显增加（P<0.05）;与M、P组相比,ST3组表现为粘附、迁移和侵袭能力明显增强（P<0.05）.利用转染技术可明显提高外源ST3Gal Ⅰ在MCF -7细胞表达,明显增加MCF-7细胞与胞外基质（ECM）粘附、迁移和侵袭能力,可形成肿瘤入侵表型,将有望成为治疗乳腺癌转移的新靶点.     

Caveolin-1真核表达载体的构建及其Hepa1-6细胞中的表达

Caveolin-1在不同肿瘤中发挥作用不同,既发挥抑癌基因样作用又发挥癌基因样作用.旨在分析caveolin-1 在小鼠肝癌细胞系中的表达情况及建立稳定表达外源caveolin-1的Hepa1-6细胞.利用RT-PCR和Western-blot方法检测caveolin-1在小鼠肝癌H22、Hea-F和Hepa1-6细胞中的表达;通过分子克隆构建小鼠caveolin-1 cDNA真核表达栽体,利用脂质体转染等方法建立稳定表达外源caveolin-1的Hepa1-6细胞株;通过RT-PCR、Western-blot、免疫细胞化学等方法鉴定其稳定表达细胞株.结果显示,caveolin-1在Hepa1-6细胞中表达呈阴性,在H22和Hca-F 中高表达;成功获得小鼠caveolin-1 cDNA真核表达载体pEGFP-N2/Cav-1,筛选并鉴定出高表达外源caveolin-1的Hepa1-6稳定细胞株C1和C4,为进一步分析caveolin-1在肝癌中所发挥的作用奠定了一定的研究基础.     

牛卵丘细胞的生长特征与转基因

目的了解牛卵丘细胞的生长特征及构建的基因载体对卵丘细胞的转染情况和转染后阳性细胞的扩增效率。方法用透明质酸酶消化牛卵丘/卵母细胞复合体(COCs)获得牛卵丘细胞,了解牛卵丘细胞的生长特点,并用分子大小分别为7178 bp和31 085 bp两种带有增强绿色荧光蛋白(EGFP)和新霉素抗性基因(Neor)的质粒载体pMSCV-EGFP-Neor和pGC1-collagen-EGFP-Neor分别转染靶细胞。结果用脂质体法转染对数生长期的细胞,均获得了绿色荧光阳性细胞,但小质粒的转染效率在72 h时是大质粒的6倍(14%vs.2.3%)。在800μg/mLG418筛选浓度下,14 d后分别获得了7个和3个较明显的单克隆细胞群,对它们进行挑选、扩大,都获得了较纯的单克隆细胞系。最后根据EGFP和collagen的已知基因序列对转染pGC1-collagen-EGFP-Neor质粒的阳性细胞进行三个不同区域DNA片段的扩增,结果表明,扩增的基因片段大小正确,数目完整。结论对卵丘细胞进行基因转染,分子大小等于或小于31 kb的基因可以有效转入,但小分子载体比大分子载体具有更高的转染效率。经过筛选都可以获得纯的转基因细胞...     

广西巴马小型猪血清淀粉样P物质基因真核载体构建及细胞转染

血清淀粉样P物质(Serum Amyloid Pcomponent,SAP)是一种在进化上高度保守的血清糖蛋白,它可与各种类型的原纤维结合,在免疫应答和炎症反应等多种免疫疾病中发挥作用.以广西巴马小型猪肝组织总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增出相应cDNA片段,连接到克隆载体pMD18-T上进行检测,测序结果为675 bp,与GenBank所提供相关序列同源性为100％,并成功构建pEGFP-N1 -SAP重组真核表达载体,利用脂质体(Lipofectamine 2000)介导法将重组质粒导入到NIH-3T3细胞中培养,经转染24 h后,置于倒置荧光显微镜下观察,发现含有重组质粒的NIH-3T3细胞中表达出绿色荧光,为进一步研究SAP基因的功能特点及在试验动物相关疾病模型的应用提供务件.