鹅圆环病毒感染性克隆的构建及其转染试验

设计带BamHⅠ酶切标记位点的引物,PCR扩增鹅圆环病毒(Goose circovirus,GoCV)全长基因组,将2个基因组顺式连接插入到pGEM-T Easy载体中,获得GoCV全长基因组头尾串联二聚体感染性克隆质粒pGEMT-2GoCV。EcoRⅠ酶切线性化pGEMT-2GoCV,与脂质体混合转染GoCV阴性鹅胚和雏鹅,常规PCR检测发现GoCV在转染鹅体内增殖,鹅胚转染组于孵出第2周和第4周检出血清阳性,且其中一个个体于4周龄扑杀时检出法氏囊阳性,雏鹅转染组于转染后2周检出血清阳性。试验进一步对扩增片段进行了BamHⅠ标记位点的检测,并应用GoCV实时荧光定量PCR方法对转染阳性样品进行了定量,结果显示阳性法氏囊组织中病毒含量为1.57×106拷贝/mg,阳性血清含病毒拷贝数在3.52×104～5.92×105拷贝/μL。综上,本试验构建的GoCV全长基因组头尾串联二聚体感染性克隆DNA可以转染鹅胚和雏鹅并增殖出带标记的GoCV克隆。     

猪细小病毒分子生物学研究进展

猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一,研究发现该病毒在进化史上相对保守,对宿主专一性高,但近年来相继发现的PPV2和PPV香港株(Porcine HoKovirus,PHoV)与PPV差异较大,对PPV、PPV2和PHoV的基因组结构、分子进化研究、复制培养现状及其蛋白表达方面研究进行了简单综述,为猪细小病毒多样性研究提供参考。     

一种温敏复制缺陷T载体的构建及在鸡白痢沙门氏菌基因敲除中的应用

基因敲除是基因功能研究的重要手段,载体是基因敲除的工具和核心。为获得有效的基因敲除载体以快速构建基因突变株及鉴定相应基因的必需性,在已有温敏复制缺陷pIDM1质粒的基础上,于EcoRⅠ和PstⅠ位点间插入串联的XcmⅠ酶切位点接头,构建了pIDM-T质粒;该质粒经XcmⅠ酶切可获得末端突出T的线性化pIDM-T载体。在验证了pIDM-T质粒复制的温敏特性基础上,应用构建的T载体克隆鸡白痢沙门氏菌CVCC527菌株的eno和ybdr两个基因,鉴定获得pIDM-T_eno和pIDM-T_ybdr两个重组质粒;将重组质粒转化527菌株,经IPC(Integration rate per cell)值计算,鉴定eno为必需基因,ybdr为非必需基因。挑取非必需ybdr基因527菌株重组菌(SalΔybdr),经PCR和测序,确认突变菌株重组位点的正确性。pIDM-T载体可快速克隆PCR产物,用于沙门氏菌的基因敲除及必需性鉴定,为沙门氏菌基因功能研究提供了一种有效快速的手段。