真核蛋白编码基因核心启动子结构研究进展

真核蛋白编码基因核心启动子结构研究进展李明,陆长德（中国科学院上海生物化学研究所,上海２０００３１）关键词核心启动子,ＴＡＴＡ盒,起始子（Ｉｎｒ）真核生物ＲＮＡ聚合酶ＩＩ起始包括蛋白编码基因在内的ＩＩ类基因的转录。蛋白编码基因中转录起点的－３０到＋３...     

目的Ribozyme两侧长片段附加列（LAS）的去除及其转录载体构建

选择小鼠腺苷脱氨酶ｍＲＮＡ特异Ｒｉｂｏｚｙｍｅ做为目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ（Ｒｚ）,在目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ两侧分别设计５－顺式Ｒｚ和３－顺式Ｒｚ,在目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ上设计ＢｍＨＩ酶切位点,并构建了上述Ｒ８ｂｏｚｙｍｅ转录载体ｐＳＣＲｚ２６２,采用该质粒进行体外转录,并对转录靶ＲＮＡ分了进行了切割反应,结果显示ｐＳＣＲｚ２６２在转录过程哪生了自身切割,并释放出目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ－Ｒｚ２６２,该目的     

目的Ribozyme两侧长片段附加序列（LAS）的去除及其转录载体构建

选择小鼠腺苷脱氨酶ｍＲＮＡ特异Ｒｉｂｏｚｙｍｅ做为目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ（Ｒｚ）,在目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ两侧分别设计５＇－顺式Ｒｚ和３＇－顺式Ｒｚ,在目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ上设计ＢａｍＨＩ酶切位点,并构建了上述Ｒｉｂｏｚｙｍｅ转录载体ｐＳＣＲｚ２６２,采用该质粒进行体外转录,并对转录靶ＲＮＡ分子进行了切割反应。结果显示ｐＳＣＲｚ２６２在转录过程中发生了自身切割,并释放出目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ－Ｒｚ２６２,该目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ不但去除了两侧长片段附加序列,而且保持了正确的生物学活性,通过ＢａｍＨＩ切点的设计简化了该质粒的筛选。     

人p53蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表

将人p53基因装入Pichia分泌型质粒Phil-S1中,酶切线性化后电穿孔导入酵母细胞进行整合,经筛选得到一高表达p53蛋白的克隆。SDS-PAGE显示表达量约占分泌总量的30%。ELISA验证重组人p53存在免疫学活性。在诱导时就降低Pichia酵母系统水解酶活力等方面进行优化,经FPLC分离纯化得到约200mg/L表达量。     

寡聚核苷酸用于治疗的前景探讨

寡聚核苷酸用于治疗的前景探讨陆长德（中国科学院上海生物化学研究所２０００３１）具有专一顺序的寡聚核苷酸可用于阻断有害基因的表达,是一种全新的治疗方法。由于它具有很高的特异性,它的降解产物对人体无毒,因此很有吸引力。近年来,寡聚核苷酸用于治疗的研究已进人动物和临床试验阶段,表现出很大的潜力。一、寡聚核苷酸阻断墓因表达的作用机制根据基因表达的中心法则,从贮存在ＤＮＡ中的信息产生有功能的蛋白质,其其中间体是信使RNA。     

细胞周期中DNA复制的控制

细胞周期中ＤＮＡ复制的控制陆长德（中国科学院上海生物化学研究所２０００３１）真核细胞ＤＮＡ复制发生在细胞周期的Ｓ期,细胞ＤＮＡ复制的控制从狭义上看发生在ＤＮＡ复制的起始上;从广义上看,也发生在参与ＤＮＡ复制的酶和蛋白质因子的基因表达调控上。关于这些调控机制虽然远还没搞清,但也取得了一些进展,与近来细胞生物学,以及肿瘤研究的一些进展结合起来,可以说已初露端倪。进一步研究真核细胞ＤＮＡ复制的控制进一步研究真核细胞DNA复制的控制无疑对于搞清细胞周期在G1\S 期的控制机制具有重要意义。 要意义。     

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的“碱基选择”作用

用双脱氧核苷酸研究了大肠杆菌ＤＮＡ聚合酶Ⅰ的Ｋｌｅｎｏｗ片段的“碱基选择”作用．当引物末端为３’ＯＨ时,Ｍｎ２＋代替Ｍｇ２＋对ｄＮＴＰ的Ｋｍ影响不大,而使ｄｄＮＴＰ的Ｋｉ大大降低,非配对的ｄｄＮＴＰ仍无抑制作用。当引物末端为ｄｄＮＭＰ且与模板配对时是ＤＮＡ合成的抑制剂,与模板配对的下一个ｄＮＴＰ可增强这一抑制作用,Ｍｎ２＋代替Ｍｇ２＋使ｄＮＴＰ的诱导作用大大增强而ｄｄＮＴＰ无诱导作用。这些结果表明引物末端对于酶选择核苷酸起着重要作用,ＤＮＡ聚合酶Ⅰ选择核苷酸的过程应是个有序的构象变化的过程。下一互补核苷酸的结合抑制３＇→５＇外切活性对引物末端ｄｄＮＭＰ的水解作用为此提供了又一证据。     

专一地切割苜蓿夜蛾核多角体病毒多角体蛋白Mrna的ribzyme*的设计与性质”

本文针对苜蓿夜娥Autographa californica核多角体病毒的多角体蛋白mRNA设计并合成了两个ribozyme体外实验结果表明它们都能准确、高效地切割体外转录得到的mRNA片段。实验表明,在一定的范围内,切割百分率随着温度的升高、时间的延长和ribozyme浓度的提高而增加。Ca²⁺、Mn²⁺可以代替Mg²⁺作为ribozyme切割反应所必需的二价金属离子。     

多酶单一切点Tac启动子质粒pTL的组建与应用

本工作组建了一个含Tac启动子(promoter)的表达载体质粒pTL。pTL带有Trp-35区、Lac-10区及两个终止区(t_1t_2),并带有EcoRⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、PstI及HindⅢ等单一酶切点,可以在这些切点中插入各种基因片段,由Tac启动子促进基因的表达。在Ap抗性基因中无PstⅠ切点,故在PstⅠ切点插入外源基因后,Ap抗性不受影响。用pTL表达人干扰素αD基因,获得较高的产率,每立升菌液约得8.2×10~7单位,相当于每立升4mg干扰素。