重组人源性胶原蛋白的制备及表征

为了获得可实现工业化生产的重组人源性胶原蛋白,根据人I型胶原蛋白Gly-X-Y序列,优选亲水性的Gly-X-Y胶原肽段设计人源性胶原蛋白氨基酸序列及对应的核苷酸序列,利用酶切技术构建pPIC9K-COL表达载体,电转化毕赤酵母获得人源性胶原蛋白毕赤酵母工程菌,并对其进行发酵罐发酵、纯化及鉴定。结果显示,获得表达量达4.5 g/L,纯度大于95%的人源性胶原蛋白,经氨基酸N端测序、分子量测定、氨基酸分析及胶原酶降解试验,确定获得的蛋白与理论的人源性胶原蛋白一级结构一致;同时胶原经冷冻干燥后进行扫描电镜分析及细胞毒性试验,确定人源性胶原蛋白冻干品具有多孔纤维网状结构及优良的细胞相容性,预示其具备作为生物医学材料的潜质。     

利用红外相机公里网格调查钱江源国家公园的兽类及鸟类多样性

2014年5月至2019年4月, 作者采用红外相机技术调查了浙江省钱江源国家公园的兽类及鸟类多样性。将整个国家公园划分为267个1 km × 1 km的调查网格, 每个网格内设置3个固定调查位点, 使用1台红外相机定期在同一网格内的位点之间进行轮换。其中, 古田山片区在5年内共完成14轮次调查, 古田山以外的区域自2018年7月纳入调查范围, 何田、长虹片区完成2次轮换, 齐溪片区完成1次轮换。在253个网格内的741个有效位点上共获得140,413个相机工作日的数据, 采集兽类和鸟类的照片和视频268,833份, 有效探测数74,368次, 鉴定出21种野生兽类, 72种野生鸟类, 5种家畜及家禽。包括国家一级重点保护野生动物2种, 即黑麂(Muntiacus crinifrons)、白颈长尾雉(Syrmaticus ellioti); 国家二级重点保护野生动物17种, 合计占野生物种总数的20.4%。被IUCN物种红色名录评估为易危(VU)的5种, 近危(NT)的4种, 合计占物种总数的9.7%。被中国脊椎动物红色名录评估为濒危(EN)的1种, 易危(VU)的9种, 近危(NT)的10种, 合计占物种总数的21.5%。相对多度指数最高的大中型兽类为小麂(Muntiacus reevesi), 鸟类为白鹇(Lophura nycthemera)。本次调查获得了国家公园内兽类和鸟类的多样性组成、空间分布和相对多度, 为长期科研监测和科学管理提供了基础数据。     

主要组织相容性复合体单倍型鸭抗原处理相关转运体单抗的制备

目的制备鸭抗原处理相关转运体(TAP)特异性单抗,为深入利用实验鸭开展免疫学研究提供实验材料。方法利用大肠埃希菌诱导表达主要组织相容性复合体(MHC)单倍型HBW-SPF鸭TAP蛋白肽结合区片段,表达产物经镍柱纯化后免疫BALB/c小鼠,采用ELISA技术筛选特异性单抗分泌杂交瘤细胞株。将阳性细胞株制备小鼠腹水,作为一抗,与多次截短表达TAP蛋白肽结合区进行蛋白免疫印迹试验,鉴定单抗针对的抗原表位。通过间接免疫荧光试验比较该单抗对实验鸭和鸡外周血淋巴细胞的反应性,利用免疫组织化学技术检测对SPF鸡、SPF鸭、鹌鹑、鹅和SPF猪的特异性。结果获得一株鸭TAP单抗1A6,抗原表位位于²⁹⁷NARHQMLQQAVLDATAGTGMVVQEAI³²²,对鸡和鸭外周血淋巴细胞具有免疫荧光反应性;在鸡和鸭的肠黏膜固有层检测到大量特异性信号,在猪、鹌鹑和鹅没有检测到信号。结论获得了一株具有鸡和鸭反应性的抗原转运相关体特异性的单抗,可运用于禽类实验动物在禽病学和禽免疫学方面的研究。     

人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的构建及验证

目的利用人源抗狂犬病病毒ScFv噬菌体抗体库,构建单克隆抗体(单抗)轻、重链质粒,瞬时表达,纯化后验证具有高中和活性的单抗。方法以从ScFv噬菌体抗体库中筛选获得特异性抗体为模板,PCR扩增抗体轻、重链可变区序列,构建人源全分子抗体瞬时转染质粒;轻、重链质粒混合后转染HEK293 EBNA1细胞,瞬时表达全分子抗体。采用Mabselect SuRe介质手动亲和纯化抗体,Nano Vue超微量分光光度计测定蛋白质的质量浓度,快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT)进行体外中和效价验证。结果成功构建22个轻链质粒,15个重链质粒。通过真核细胞瞬时表达后,经手动亲和纯化后,获得22株单抗。除1株抗体外,其余21株抗体的蛋白质量浓度均>300μg/mL;部分抗体纯度均在90%以上。中和活性结果显示,5株在1 500~1 800 IU/mg之间;8株在800~1 500 IU/mg之间;7株在500~800 IU/mg之间;其余2株在500 IU/mg以下。结论成功构建并验证获得20株中和活性>500 IU/mg的人源抗狂犬病病毒单抗,为单抗混合制剂的研究奠定了基础。     

在小鼠模型中抗闭锁蛋白单克隆抗体完全阻止了丙型肝炎病毒的感染

丙型肝炎病毒(HCV)进入宿主细胞的过程分多步完成。过程中需要多种宿主因子,闭锁蛋白(OCLN)作为紧密连接蛋白被包括在内,并且体外细胞培养系统业已表明其在HCV感染过程中不可或缺。然而,由于缺乏能够识别完整OCLN细胞外环状结构域并抵御HCV感染的连接子,研究者们尚不清楚OCLN是否能够作为HCV治疗手段中有效且安全的目标物。通过使用基因免疫法和独特细胞差异化筛选技术,研究者成功制备了四种大鼠抗OCLN单克隆抗体(mAb)。     

茄科劳尔氏菌单克隆抗体的制备及其特性鉴定

茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum,RS)是番茄、茄子、辣椒、马铃薯等茄科蔬菜青枯病害的致病菌。为实现对RS的快速高效检测,以茄科劳尔氏菌株1.76免疫BALB/c小鼠,经细胞融合后利用间接酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)筛选出3株能稳定分泌抗茄科劳尔氏菌株1.76的单克隆杂交瘤细胞株1C1、1B3和9D7。然后利用小鼠体内诱生腹水,1C1、1B3和9D7效价分别为1:1 024 000、1:64 000、1:256 000。采用饱和硫酸铵沉淀及Protein-G亲和层析法纯化腹水,经SDS-PAGE鉴定显示纯化后的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies,mAb)纯度较高。纯化后单克隆抗体(2 mg/mL)效价分别为1:17 529、1:35 819、1:50 000,抗体亚型均为IgG1。对3株抗体进行特异性检测结果显示,1C1和9D7均不能与RS-5结合,1B3不能结合1.74和RS-5。此外,检测结果还表明3株单克隆抗体与桑肠杆菌JX-6、苏云金芽胞杆菌SYJ及实验室现有11株燕麦嗜酸菌卡特莱兰亚种、燕麦嗜酸菌西瓜亚种、玉米细菌性条斑菌、嗜酸菌魔芋亚种,梨火疫病菌QB0809、 XL-4,玉米细菌性枯萎病菌QB0241、QB0242,水稻细菌性谷枯病菌QB0017、QB0753、QB0755均无交叉情况。此次茄科劳尔氏菌抗体的制备,为后期青枯病菌的快速检测提供参考。     

三种植物源药剂对红火蚁的防治效果评估及其对本地蚂蚁群落影响

红火蚁Solenopsis invicta Buren是一种危险性入侵害虫,可对人类健康、农林业生产、公共安全和生态系统产生严重的负面影响。目前,化学农药是防治红火蚁的主要方法。然而,大多数化学农药并不适用于有机农场、水产养殖区等生态敏感区。为筛选出用于生态敏感区红火蚁防治的药剂,本文结合室内和田间试验评估了植物源杀虫剂苦参碱Matrine、鱼藤酮Rotenone和除虫菊素Pyrethrin对红火蚁的防治效果。室内试验结果表明,苦参碱、鱼藤酮和除虫菊素对红火蚁均具有较高的毒性。田间试验表明,25.00 mg/L和12.50 mg/L苦参碱、250.00 mg/L 和125 mg/L鱼藤酮、75.00 mg/L和37.50 mg/L除虫菊素灌巢处理,红火蚁蚁巢减退率分别达到100%、81.25%、87.50%、79.17%、71.73%和66.67%。然而,除25.00 mg/L苦参碱外,其他处理均导致在被灌巢的蚁巢周围短期内出现新蚁巢。灌巢处理后,处理区的蚂蚁多样性指数和均匀度指数升高,优势度指数下降。综上所述,苦参碱、鱼藤酮和除虫菊素适合灌巢处理防治红火蚁,其中0.5%苦参碱可溶性液剂能有效降低红火蚁种群数量,使得蚁巢减退率达100%,同时对本地蚂蚁群落没有负面影响,因此该商品制剂在红火蚁防治方面具有较好的开发潜力。     

慢性肺源性心脏病患者血清白细胞介素-6、降钙素原、D-二聚体、N端B型脑钠肽前体与心功能分级和预后的关系研究

摘要 目的：探讨慢性肺源性心脏病（CCP）患者血清白细胞介素-6（IL-6）、降钙素原（PCT）、D-二聚体（D-D）、N端B型脑钠肽前体（NT-proBNP）与心功能分级和预后的关系。方法：选取2020年1月～2021年5月合肥市第一人民医院全科医学科及呼吸与危重症科收治的170例CCP患者（CCP组）,其中纽约心脏协会（NYHA）心功能分级Ⅱ级49例、Ⅲ级66例、Ⅳ级55例,根据1年后存活状况分为死亡组26例和存活组144例,另选取同期54名体检健康者（对照组）。收集CCP患者临床资料,采用酶联免疫吸附法检测血清IL-6、PCT、D-D、NT-proBNP水平。通过多因素Logistic回归分析CCP患者预后不良的影响因素,受试者工作特征（ROC）曲线分析血清IL-6、PCT、D-D、NT-proBNP水平对CCP患者预后不良的预测价值。结果：与对照组比较,CCP组血清IL-6、PCT、D-D、NT-proBNP水平升高（P＜0.05）。Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级CCP患者血清IL-6、PCT、D-D、NT-proBNP水平依次升高（P＜0.05）。单因素分析显示,死亡组NYHA心功能分级Ⅳ级、肺动脉收缩压、Tie指数和血清IL-6、PCT、D-D、NT-proBNP水平高于存活组,第1秒用力呼气容积（FEV₁）占预计值％、FEV₁/用力肺活量（FVC）、三尖瓣环收缩期位移低于存活组（P＜0.05）。多因素Logistic回归分析显示,NYHA心功能分级Ⅳ级和肺动脉收缩压、IL-6、PCT、D-D、NT-proBNP升高为CCP患者预后不良的独立危险因素,FEV1占预计值％升高为独立保护因素（P＜0.05）。ROC曲线分析显示,血清IL-6、PCT、D-D、NT-proBNP水平单独与联合预测CCP患者预后不良的曲线下面积分别为0.789、0.789、0.792、0.801、0.954,灵敏度分别为93.33％、66.67％、66.67％、86.67％、86.67％,特异度分别为46.67％、82.67％、85.33％、66.67％、94.67％。血清IL-6、PCT、D-D、NT-proBNP水平联合预测CCP患者预后不良的AUC大于单项预测（P＜0.05）。结论：CCP患者血清IL-6、PCT、D-D、NT-proBNP水平升高可增加心功能严重程度并导致预后不良,可作为CCP患者预后不良的辅助预测指标,且四项指标联合检测具有更好的预测效能。     

不同治疗方案对原发免疫性血小板减少症患者外周血调节T细胞水平变化的影响及其意义分析(英文)

目的:探讨原发免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)患者治疗前后外周血调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)水平变化及其在ITP发病中的作用。方法:选取2010年6月至2013年7月间276例新诊断ITP患者,男114例、女162例,中位年龄40(18-70)岁。按治疗方案随机分为地塞米松组(90例):地塞米松40 mg/d第1~4天口服;泼尼松组(98例):泼尼松1.5 mg·kg-1·d-1口服;2泼尼松组(98例):泼尼松1.5 mg·kg-1·d-1口服;地塞米松+小剂量利妥昔单抗组(88例):地塞米松40 mg/d第1-4天口服,利妥昔单抗100 mg第7、14、21、28天静脉滴注。各组患者于治疗前、治疗后14 d和28 d分别采取外周静脉血,采用流式细胞术检测CD4+CD25+CD127-细胞水平。以60名健康体检者为正常对照组。结果:治疗后第28天,地塞米松组、泼尼松组、地塞米松+小剂量利妥昔单抗组的总有效率分别66.7%、69.4%、79.5%,差异无统计学意义;随访12个月,泼尼松组(37.8%)和地塞米松组(22.7%)之间差异无统计学意义,而与地塞米松+小剂量利妥昔单抗组持续有效率(66.7%),差异有统计学意义(P0.05)。所有ITP患者治疗前外周血CD4+CD25+CD127-细胞表达水平低于健康对照组[(1.66±0.69)%对(4.01±0.38)%,P0.05];地塞米松组、泼尼松组患者治疗后14d CD4+CD25high CD127low细胞水平均高于治疗前[(3.46±0.76)%对(1.68±0.72)%、(3.22±0.77)%对(1.69±0.74)%,P值均0.05];地塞米松+小剂量利妥昔单抗组治疗后14、28d CD4+CD25+CD127-细胞水平[(4.27±1.08)%、(4.43±0.62)%]均高于治疗前[(1.67±0.67)%],差异有统计学意义(P值均0.05);治疗后28 d,泼尼松组、地塞米松组患者CD4+CD25+CD127-细胞水平[(2.68±0.63)%、(2.58±0.66)%]与治疗前比较差异无统计学意义。结论:地塞米松联合小剂量利妥昔单抗在长期疗效及提升T细胞数量方面显著优于地塞米松和泼尼松,值得临床推广。     

一起沙门菌引起的食源性疾病爆发的溯源分析

目的:对一起沙门菌引起的食源性疾病爆发进行溯源分析。方法:采用GB4789法对采集的样品进行分离及鉴定,采用16S r RNA基因分型方法及PFGE分型方法对分离的菌株进行分子生物学分析,并对爆发进行溯源分析。结果:生化及血清学结果表明,该起爆发分离的菌型为伦敦沙门氏菌。16S r RNA基因分型表明爆发所分离的菌株均为肠道沙门菌肠道亚种,菌株12 sam与其他4个菌株分子发育距离较远,均为16S r RNA基因分型的TYPE1-11型;PFGE分型结果表明菌株10 sam、16 sam、27 sam及29sam的PFGE带型相似度为100%,菌株12sam跟其他菌株相似率为96%。结论:GB4789法结果表明该起爆发是由伦敦沙门氏菌引起的,16S r RNA基因分型及PFGE分型方法的结果均表明该起食源性疾病来源一致。