RNA干扰技术及其在细胞周期研究中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNA i)是由双链RNA(doub le-stranded RNA,dsRNA)引发的转录后基因沉默(posttran-scridptional gene silenc ing,PTGS)。dsRNA经D icer酶降解成21-23nt的siRNA,并以其为模板,特定位点、特定间隔降解与之序列相应的mRNA。随着RNA i机制的深入研究与广泛应用,目前该技术已经普遍应用于细胞周期研究中,在阐明各种调控机制的同时也为基因治疗提供了新靶点。     

针对多效蛋白基因的小干扰RNA的设计及其稳定表达载体的构建

目的:设计多效蛋白基因特异性的小干扰RNA(siRNA),并构建一系列能在哺乳动物细胞内稳定表达这些siRNA的表达质粒,以便为在体外研究多效蛋白基因的功能打下基础。方法:设计并合成具有多效蛋白基因特异性的一组寡核苷酸片段,并克隆到pSilencer3.1-H1hygro载体;用脂质体LipofectAMINE2000转染和潮霉素筛选等方法建立能稳定表达相应siRNA的一组Pten-/-细胞克隆;利用Northern印迹检测这些细胞内多效蛋白基因的表达情况。结果:设计并构建了3个针对多效蛋白基因的siRNA表达质粒,并证明其中的1种质粒能在Pten-/-细胞内稳定表达相应的siRNA,并显著地抑制了该细胞多效蛋白基因的表达。结论:设计并构建出的针对多效蛋白基因的siRNA表达载体所表达的siRNA具有较强的RNA干涉功能,为多效蛋白基因的功能研究奠定了实验基础。     

猪VHL基因克隆及敲低克隆胚胎的构建

通过在细胞和胚胎水平对猪Von Hippel-Lindau(VHL)基因进行了基因敲低研究,以便为建立VHL疾病模型猪奠定基础.研究首先通过 3'RACE和5'RACE克隆得到猪VHL基因cDNA全长序列(2 725 bp),Real-time PCR结果表明VHL基因广泛表达于猪的各种组织器官,其中在肾上腺、肝脏、胰腺、心脏和睾丸等组织器官高量表达.进一步在猪iPS细胞中对5条干扰片段进行筛选,获得2条高效的干扰片段,干扰效率分别达到72％(P=0.0012)和64％ (P＜ 0.01).以稳定干扰VHL基因的猪胎儿成纤维细胞为核供体,构建克隆胚胎,结果表明,克隆胚胎的发育能力与对照组相比没有明显差异,而且在克隆囊胚中VHL基因的干扰效率达到71％ (P＜ 0.01).综上所述,文中获得了猪VHL基因全长序列并获得该基因稳定敲低的猪细胞和胚胎,从而为VHL疾病模型猪的构建奠定了良好的基础.     

云南苍山火烧迹地不同恢复期地表蜘蛛群落多样性

为了解云南苍山针阔混交林火烧迹地恢复过程地表蜘蛛群落多样性变化,于2009年1月份-2009年12月份,运用陷阱法,以“空间序列代替时间序列”,调查了苍山森林火干扰后不同恢复期样地(火干扰后2、10、18、23、33a和对照样地)地表蜘蛛多样性.研究结果表明,(1)物种组成及相对多度:不同恢复期随着恢复时间的增加优势类群更替趋势明显;(2)多样性:恢复1Oa样地地表蜘蛛群落多度显著大于其他恢复期(P＜0.05),而不同恢复期地表蜘蛛物种多样性却没有显著差异;(3)群落相似性:PCoA相似性分析将地表蜘蛛群落发展过程划分为火烧后2a、火烧后10a和火烧后18-33a 3个阶段;(4)指示物种:西菱头蛛Sibianor sp.1等是阶段1的指示物种,格氏狼蛛Lycosa grahami等是阶段2的指示物种,花蟹蛛Xysticus sp.2等是阶段3的指示物种,弱蛛Leptoneta sp.1等是对照的指示物种.火干扰改变了苍山针阔混交林原有的地表蜘蛛群落多样性;指示物种对生境的选择能够反映出不同恢复阶段地表环境变化;5个不同恢复时期火烧迹地中恢复最久的火烧迹地地表蜘蛛群落仍没有完成恢复,说明云南苍山火迹地地表蜘蛛的恢复需要30a以上.     

不同干扰对黄土区典型草原物种多样性和生物量的影响

对黄土区典型草原进行封育+施肥(EF)、封育+火烧(EB)、封育(E)和放牧(G)处理,实地调查分析群落盖度、高度、密度、地上现存量和物种多样性,以研究不同干扰对黄土区典型草原群落物种多样性和生物量的影响.结果表明:在4种干扰类型中,施肥+封育草地群落盖度和地上生物量最高,且优势度指数最高,这与禾本科草占优势地位有关,群落均匀度指数和多样性指数最低,符合“生态位理论”;放牧地群落高度、盖度、密度和地上现存量最低,群落丰富度指数和多样性指数最高,支持“中度干扰理论”;封育地密度和均匀度指数最高;具体表现为:4种干扰类型地上生物量的变化趋势为封育+施肥＞封育+火烧＞封育＞放牧;说明长时间的封育对草地是一种严重干扰.群落丰富度指数(R和Ma)的排列顺序为放牧＞封育+施肥＞封育+火烧＞封育,群落物种多样性指数(H'和D)的排列顺序为放牧＞封育＞封育+火烧＞封育+施肥,优势度指数与多样性指数相反,群落均匀度指数(Jsw和Ea)的排列顺序为封育＞放牧＞封育+火烧＞封育+施肥.不同干扰样地群落生产力与Shannon-Wiener和Simpson 多样性指数间呈负相关关系,这个结论可以用地上/地下竞争的相互作用来解释.     

HepG2.2.15细胞中联合应用siRNA抑制HBV复制和表达的研究

观察联合应用siRNA对HepG2．2．15细胞中HBV抗原表达和复制的抑制作用。应用ELISA方法检测HBeAg和HBsAg;HBVDNA水平用实时定量PCR测定;用RT—PCR检测HBVmRNA水平。结果显示,实验中应用的HBV特异性siRNA均具有明显的抗HBV抗原表达和病毒复制作用;联合应用siRNA较单独应用具有更强的抗HBV作用。可见,HepG2．2．15细胞中联合应用siRNA对HBV复制的抑制作用比单独应用siRNA更有效。     

NF-κB p65的敲减加重结肠上皮HCT116细胞氧化损伤

炎症细胞诱导的活性氧类生成和肠道氧化应激与慢性炎症性肠疾病以及结直肠肿瘤的发病密切相关。NF-κB信号通路参与氧化应激反应以及在结直肠炎症和肿瘤发生中的作用还并不完全清楚。本研究将化学合成一对编码小干扰RNA 序列、靶向人NF-κB 基因的长60 bp寡核苷酸链定向克隆至pSUPER小干扰RNA表达载体中,通过单酶切、双酶切及测序证实重组RNA干扰载体构建成功. 将构建成功的质粒转染至结肠上皮细胞HCT116中敲减p65,分别采用Western blot方法检测NF-κB p65蛋白表达水平,（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-3,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）方法检测细胞存活情况. 结果显示,pSUPER-NF-κB p65载体可特异性下调NF-κB p65蛋白表达;下调p65表达可导致过氧化氢诱导的HCT116内活性氧类物质生成增高,存活细胞数目显著减少,氧化损伤加重。研究表明,在人结肠上皮细胞内NF-κB p65通路的抑制显著加重了结肠上皮细胞氧化损伤情况.     

旅游干扰对云丘山景区内植被的影响

选择云丘山景区为研究区域,以该区域的主要植被为研究对象,采用样方法对旅游干扰对云丘山景区内植被的影响进行了研究,共设置了40个乔木样方,并利用TWINSPAN聚类分析以及旅游干扰程度（TDD）对所取样方进行分析。结果表明：TWINSPAN聚类分类将景区内的植物群落划分为5个群系,其中、群系Ⅱ中伴人植物的优势度明显高于其它。干扰程度分析表明,在景区的40个乔木样方中,只有4个样方基本没有受到干扰,有3个样方受到中度干扰,其余的33个样方均为轻度干扰。TWINSPAN聚类分析科学合理地对旅游活动作用下植被景观的类型特征进行了分析。旅游干扰程度（TDD）直观地反映出各个样方所在地植被被干扰的程度,该研究结果可为旅游管理者提供一定的理论依据。     

滇西北高原湿地景观变化与人为、自然因子的相关性

人为活动的干扰与自然因子的变化共同作用于湿地生态系统,但两者对湿地生态系统作用的贡献率存在差异,目前尚缺乏进一步的研究。本研究基于面向对象分割和目视解译相结合的技术方法,研究了滇西北高原典型湿地纳帕海汇水区内28年来(1987—2015年)的湿地类型、分布及其空间格局的变化特征,并探讨其与当地人为活动的干扰(主要社会经济发展指标)、自然因子(主要气候因子)之间的相互关系。结果表明:(1)湿地总面积共计减少2456.46 hm~2,其中,原生沼泽、沼泽化草甸和草甸面积分别减少了1152.07,1257.72,202.74 hm~2,湖泊面积增加了156.07 hm~2;(2)湿地景观多样性发生显著变化,其中,斑块数量(NP)由1987年的221增加到2005年的299,随后减少到2015年的260;香农多样性指数(SHDI)由1987年的1.81增加到1999年的1.84,随后减少到2015年的1.75;聚集度指数(contagion index)由1987年的52.82减少到1999年的52.02,随后增加到2015年的53.49;(3)湿地分布面积和香农多样性指数与第一、二、三产业值,以及年均温度呈负相关,与降水量呈正相关;斑块数量、聚集度指数均与第一、二、三产业值,以及年均温度呈正相关,与降水量呈负相关;(4)社会经济发展主要指标对湿地面积和景观多样性指数变化的解释度为63.50%,气候因子对其的解释度为36.50%。整体上,人为活动的干扰是导致该区域湿地不断萎缩、景观多样性改变的关键驱动力。减缓人为活动对湿地生态系统的过度影响,是当地保护湿地资源、维护湿地生态功能的关键。     

践踏干扰对碧塔海高寒草甸植被茎叶性状、物种多样性和功能多样性的影响

高寒草甸具有重要的生态服务功能,然而固有脆弱性使其极易遭受气候变化和人为干扰等多重因素的影响。作为滇西北旅游资源中重要的组分之一,高寒草甸吸引了大批游客前往开展徒步旅行活动,但伴随着的践踏干扰作用会不可避免地对高寒草甸生态系统带来负面影响。然而,目前关注践踏干扰对滇西北高寒草甸植被的影响,特别是植被功能性状和功能多样性如何发生变化方面的研究还十分欠缺。以云南省香格里拉市碧塔海自然保护区内的典型高寒草甸生态系统为研究对象,采用实验践踏的方式(一共5种不同强度的践踏处理)来模拟旅游活动对草甸植被的干扰作用,并以草甸植被的茎叶性状特征为切入点,重点探讨践踏干扰对茎叶性状的平均大小和变异程度的影响,以及物种丰富度(以物种形态分类为基础)和功能丰富度(以功能性状为基础)之间的关系。研究结果显示,随着践踏强度的增加,植株高度和叶片大小的平均值,而不是茎叶性状的变异程度,出现明显下降趋势。此外,物种丰富度和功能丰富度均随践踏强度的增强而减小,且两者之间呈现显著正相关关系。然而,较之轻度践踏实验组,重度践踏实验组中的功能均匀度和功能分离度水平均有所增加,表明践踏干扰可能会在短期内打破优势种对资源的绝对占有格局和减少物种间的生态位重叠程度。尽管高寒草甸对人类践踏活动有一定的承受能力,但气候变化和人为干扰等多重因素势必会改变和影响高寒草甸群落的结构和功能可持续性,这也对高寒草甸的保护与管理工作提出了更加紧迫的要求。