斑地锦RT-qPCR内参基因的筛选

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的前提条件之一是具有合适的内参基因。为筛选斑地锦(Euphorbia maculata)合适的RT-qPCR内参基因,该文利用同源克隆法克隆斑地锦GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP等基因片段,RT-qPCR检测7个候选内参基因在斑地锦不同生长期根、茎、叶和果实中的表达情况,并用geNorm、NormFinder和BestKeeper等生物学软件对各候选基因表达稳定性进行评价。结果表明:(1)克隆的GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP基因片段为729、808、753、422、233、656、313 bp,分别编码242、269、250、140、77、218、103个氨基酸,与其他植物相应氨基酸序列的最高同源性均在85%以上。(2)综合3个分析软件分析内参基因表达稳定性得出,表达稳定性排名为UBQ>EF-1α>TUB-α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act。因此,可以选取UBQ作为斑地锦RT-qPCR分析的内参基因,用于不同生长期基因组织特异性表达研究。     

大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭基因ibeB的编码产物为外膜蛋白前体

为进一步探讨大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭基因ibeB的生物学特性 ,将ibeB基因克隆到pET2 8a(+)载体 ,以E .coliBL2 1 (DE3)为宿主菌 ,经IPTG诱导后 ,通过Ni2 + NTA树脂提纯IbeB蛋白 .SDS PAGE确定纯化蛋白的分子量 ;应用无蛋白酶的体外转录和翻译系统进一步鉴定ibeB基因表达蛋白的分子量 ;通过 [3 5S]Met标记的体内T7表达体系并结合膜蛋白分离技术定位IbeB蛋白在细菌中的亚细胞分布 ;利用细菌侵袭实验分析IbeB蛋白抗体对E .coliK1侵袭人脑微血管内皮细胞的封闭作用 .结果发现 ,ibeB基因的重组蛋白表达纯化产物呈现出 5 0kD和 34kD两种分子量大小 ,5 0kD存在于表达细菌的可溶性部分 ,而 34kD则存在于包涵体中 ;体外翻译实验也显示出较弱的 5 0kD和较浓的 34kD两个蛋白带 ;体内T7表达体系实验显示 34kD的IbeB成熟蛋白定位于E .coli的外膜 ;抗 34kDIbeB蛋白抗体能封闭E .coli对人脑微血管内皮细胞的侵袭 .这些结果提示 ,大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭基因ibeB的编码产物为 5 0kD的外膜蛋白前体 ,该前体可通过分子内剪接形成成熟的 34kDIbeB蛋白     

感染组学 (infectomics) ———对感染性疾病的总体性和综合性研究

在感染性疾病的范畴内,目前急需一个能有效地、精确地和综合性地研究微生物感染的结构性和功能性基因组学和蛋白质组学 ( 感染组学 ) 的全面方法. 新的方法 ( 如 DNA 和蛋白质微阵列 ) 和传统方法 ( 如分子克隆、 PCR 、基因敲除,加进 (knockin) 和反义术等 ) 的结合将有助于克服今天的困难. 在感染时,微生物及其宿主的全部表型改变 ( 感染组 ) 均由微生物病原体及其宿主的基因组所编码,并在特异的微生物 - 宿主相互作用时的某些环境条件下表达. 微生物及其宿主的全部药物反应 ( 药理组 ) 可用基因组或蛋白质组的方法检出. 分析基因型和表型或表达形式的全基因组方法将最终导致对微生物的发病机理、感染性疾病的快速诊断和控制感染的新策略的全面研究. 感染性疾病中最基本的问题是,如何全面地和综合性地应用感染组学,来了解微生物病原体及其宿主的相互作用.     

植物含油量相关转录因子WRINKLED1的研究进展

植物油具有重要的食用和工业价值,对其需求越来越大。提高作物种子含油量育种一直在进行,与通过单一限速酶的遗传工程法相比,利用转相关转录因子基因改造植物脂肪代谢过程是更好选择之一。介绍植物含油量相关转录因子WRINKLED1的发现、结构、功能、调控、基因工程和聚类分析等,并对其应用前景进行展望。     

脑膜炎大肠杆菌K1株ppk1基因致病机制初探

【目的】构建脑膜炎大肠杆菌K1(Escherichia coli,E.coli K1)株E44的聚磷酸盐激酶1(Polyphosphate kinase 1,PPK1)基因敲除株,并对其生物学功能进行初步研究,为明确ppk1基因在E.coli K1株致脑膜炎机制中的作用奠定基础。【方法】利用自杀质粒pCVD442及基因同源重组技术敲除E.coli K1株E44中的ppk1基因,构建ppk1缺失突变株Δppk1;体外比较野生株和突变株在低营养及氧化压力情况下的生存能力;考察二者对人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cells,HBMEC)的黏附能力;通过测定乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)释放活性,比较野生株和突变株对HBMEC的损伤效应。【结果】PCR及序列分析证实,突变株缺失全长ppk1基因。与野生株E44相比,ppk1突变株Δppk1在低营养环境中和氧化刺激条件下的生存能力明显降低。相对于E44,Δppk1对HBMEC的黏附能力减弱。与HBMEC孵育后,突变株孵育组HBMEC的LDH释放活性明显低于野生株孵育组。【结论】ppk1对E.coli K1株E44在低营养环境中的生存、抵抗氧化压力,以及黏附HBMEC和对细胞的毒性损伤有重要作用。     

大肠杆菌K1致病株外膜蛋白T体外功能

纤溶酶原激活及水解抗菌肽利于致病菌侵袭及体内存活。【目的】构建大肠杆菌K1致病株E44的ompT基因缺失突变株,证实E44外膜蛋白T(OmpT)体外激活纤溶酶原及水解抗菌肽鱼精蛋白的活性。【方法】采用基因同源重组技术敲除大肠杆菌K1株E44中的ompT基因,构建ompT缺失突变株;二步柱层析纯化E44外膜组分,S-2251发色底物法测定其纤溶酶原激活活性;考察野生株E44、ompT基因敲除株E44ompT及转化带有ompT完整阅读框的质粒pUCT的E44ompT/pUCT三者对0.1mg/mL阳离子抗菌肽鱼精蛋白的敏感程度。【结果】利用自杀性载体pCVD442和同源重组的原理构建E44的ompT基因敲除株E44ompT;纯化得到约37kDa的E44外膜组分,S-2251发色底物法证实其具有纤溶酶原激活活性,纤溶酶原激活与膜组分的加入量呈一定量效关系;与野生株E44相比,ompT敲除株E44ompT对0.1mg/mL鱼精蛋白敏感,转化入带有ompT完整序列的质粒pUCT有一定的回补作用,E44ompT部分恢复抗鱼精蛋白能力。【结论】外膜蛋白T在致病株E44中有表达,并具有激活纤溶酶原及水解鱼精蛋白的活性。     

口服微生态制剂对孕妇肠道和阴道大肠杆菌K1和B族链球菌定殖的干预

【目的】本研究主要从临床探讨口服益生菌对孕妇微生态环境(阴道和肠道)中Escherichia coli K1和B族链球菌(GBS)定殖率的影响以预防新生儿血流播散性细菌性脑膜炎。【方法】收集2011年至2017年期间在广东省范围门诊就诊的2539例妊娠健康孕妇的阴道、直肠分泌物。选择符合要求的32孕周孕妇47例随机分成两组,其中益生菌组22例,对照组25例,用荧光定量PCR检测不同组孕妇体内服药前、后的微生态环境中大肠埃希菌的变化。然后选择50例GBS筛查阳性的35孕周孕妇,随机分成益生菌组和对照组,荧光定量PCR检测不同分组孕妇体内微生态环境中GBS定量变化。同时使用荧光PCR筛查对临床收集的2539例孕晚期(35周)孕妇生殖道、直肠分泌物标本进行GBS检测并计算携带率。【结果】研究前对不同组别孕妇的基本资料进行差异分析,结果显示两组在年龄差别、经产妇比例和受教育水平3个方面比较均无差异(P0.05),证明不同组间孕妇具有可比性。然后观察上述不同组别的孕妇服用益生菌体内微生态状况,用荧光定量PCR方法进行检测,结果显示用益生菌组在服药前后,阴道和直肠分泌物中大肠杆菌数量显著下降(F=32.866,P0.001),孕妇服用益生菌后E. coli K1的数量显著低于服用益生菌前(P0.05),且益生菌组与对照组相比大肠杆菌数量显著下降(P0.05,F=41.546,P0.001);同时检查服益生菌组孕妇体内GBS的变化,荧光定量PCR检测结果显示服用益生菌前后GBS的定殖数量有降低趋势,且与对照组相比有下降趋势。最后我们用荧光定量PCR筛查孕晚期妇女B族链球菌带菌状况,其GBS携带率为8.07%。【结论】本研究结果提示本文筛查的广东省孕晚期孕妇的B族链球菌平均携带率为8.07%,GBS可能是新生儿发生细菌性脑膜炎的危险因素之一;口服益生菌疗法可能通过抑制E. coli K1在孕妇肠道和生殖道的定殖以预防血流播散性新生儿细菌性脑膜炎。     

复制酶体的瞻望和疑问

由若干酶组成的复合体参与双链DNA分子复制过程。这种活性蛋白质复合体称为复制酶体(replitase),而具有这些酶活性的蛋白质并不能独立起作用。这种复合体在DNA复制(S期)开始时才由其各种成分装配而成,而在细胞周期的Gl期则不复存在。在真核细胞的复制酶体中,参与dNTP生物合成的酶和参与DNA复制的蛋白质结合在一起。在此复合体被装配前,细胞内先合成了大量“粘合”蛋白,以便将这些有关的蛋白质粘合在一起。在真核细胞内是否有这样的复制酶体存在是多年来一个有争论的问题。作者认为真核细胞中的复制酶体可能由细胞核内、外的两个蛋白质复合体所组成,并由两者协同完成DNA复制。如果复制酶体的存在得到证实,将会对诸如细胞周期、DNA复制、癌症发生、抗癌化学疗法和抗代谢物的生物学作用等理论,产生相当大的影响。