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目的构建大肠埃希菌(Escherichia coli)嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase,PNP)基因表达载体,研究其生物活性,为肿瘤的基因治疗奠定基础。方法PCR扩增大肠埃希菌K12的PNP基因,T4连接酶将PNP连接人pMSCV逆转录病毒载体,构建重组逆转录病毒载体pMSCV/PNP。pM—SCV/PNP转化感受态大肠埃希菌XLI-Blue,提取pMSCV/PNP,酶切、PCR和测序鉴定。病毒包装细胞293产生重组逆转录病毒pMSCV/PNP,流式细胞仪测病毒滴度。pMSCV/PNP转染胰腺癌细胞BXPC-3,倒置荧光显微镜观察,FACS分离转染阳性细胞(GFP阳性)。RT—PCR检测PNPmRNA在胰腺癌细胞BXPC-3细胞中的表达,MTT法检测PNP基因的生物活性。结果PCR扩增出大肠埃希菌PNP基因(738bp),酶切和PCR的电泳条带显示pMSCV/PNP,测序结果正常。293包装细胞产生高滴度(3.6×10^7U/m1)重组逆转录病毒pMSCV/PNP。RT—PCR实验结果表明,pMSCV/PNP转染的胰腺癌细胞BXPC-3表达PNPmRNA。前药6-甲基嘌呤-2’-脱氧核苷(MePdR)作用72h浓度达1.00mg/L,BXPC-3/PNP细胞存活率为10.09%,随着MePdR浓度加大,BXPC-3/PNP细胞存活率继续下降直至为0。结论构建了pMSCV/PNP载体,获得了表达大肠埃希菌PNP基因的BXPC-3细胞克隆,PNP/MePdR自杀基因系统对胰腺癌细胞BXPC-3有较强的抑杀作用。 相似文献
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该研究以斑地锦茎叶为材料,利用同源克隆结合RACE和Tail PCR法,克隆了1个黄烷酮 3 羟化酶(F3H)基因,命名为EmF3H(GenBank登录号为MW767838),其ORF区为1 092 bp,编码364个氨基酸。生物信息学分析显示,EmF3H蛋白相对分子质量为40.93 kD,等电点为5.47,属于2 酮戊二酸铁依赖的双加氧酶超家族,其氨基酸序列与油桐的序列相似性为85.5%,在系统进化上为相对独立的一个分支。采用Tail PCR法获得1 604 bp的EmF3H启动子序列,分析发现其内含TAAT box、CAAT box等序列和G box等光反应元件。qRT PCR结果表明,EmF3H基因在不同生长期各组织中均有表达,其中花期的根和果期的果实中表达水平最高。此结果为进一步研究EmF3H基因表达调控奠定了基础,也为完善斑地锦槲皮素生物合成途径提供了新思路。 相似文献
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Z-DNA是一种非常独特的DNA二级结构.与B-DNA相比,Z-DNA最显著的结构特征是左手螺旋和磷酸-核糖骨架呈“zigzag”状. 虽然目前对Z-DNA功能的了解还不确切,但毫无疑问,Z-DNA与基因的转录和调控密切相关. 一方面,在体内Z-DNA在基因转录过程中产生;另一方面,分布于启动子等不同区域的Z-DNA又可以反过来调控基因的转录, 即Z-DNA能够增强一些基因转录,也能抑制某些基因的表达,但其调控机制还不清楚.这种调控似乎与Z-DNA在启动子中的位置、基因和细胞类型有关.研究Z-DNA的形成及其与基因转录的关系对理解基因转录调控理论具有十分重要的意义. 相似文献
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