Bacillus pumilus WL-11木聚糖酶A的纯化、鉴定及其底物降解方式

对一株Bacilluspumilus WL_11木聚糖酶的纯化、酶学性质及其底物降解模式进行了研究。经过硫酸铵盐析、CM_Sephadex及SephadexG_75层析分离纯化,获得一种纯化的WL_11木聚糖酶A ,其分子量为26.0kD ,pI值9.5 ,以燕麦木聚糖为底物时的表观Km 值为16.6mg mL ,Vmax值为12.63μmol (min·mg)。木聚糖酶A的pH稳定范围为6 0至10 4 ,最适作用pH范围则在7.2至8.0之间,是耐碱性木聚糖酶;最适作用温度为45℃～55℃,在37℃、45℃以下时该酶热稳定性均较好;50℃保温时,该酶活力的半衰期大约为2h ,在超过50℃的环境下,该酶的热稳定较差,55℃和60℃时的酶活半衰期分别为35min和15min。WL_11木聚糖酶A对来源于燕麦、桦木和榉木的可溶性木聚糖的酶解结果发现,木聚糖酶A对几种不同来源的木聚糖的降解过程并不一致。采用HPLC法分析上述底物的降解产物生成过程发现木聚糖酶A为内切型木聚糖酶,不同底物的降解产物中都无单糖的积累,且三糖的积累量都较高;与禾本科的燕麦木聚糖底物降解不同的是,木聚糖酶A对硬木木聚糖降解形成的五糖的继续降解能力较强。采用TLC法分析了WL-11粗木聚糖酶降解燕麦木聚糖的过程,结果表明燕麦木聚糖能够被WL-11粗木聚糖酶降解生成系列木寡糖,未检出木糖,这说明WL-11主要合成内切型木聚糖酶A,同时发酵液中不含木糖苷酶,适合用来酶法制备低聚木糖。     

产芳香腈水解酶的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida CGMCC3830的筛选、鉴定及发酵优化(英文)

近年来微生物腈水解酶水解腈类化合物制备有机酸已逐步受到关注。本研究分离到一株表现出较高腈水解酶活力的细菌菌株,通过形态学、生理生化实验以及16S rRNA基因序列分析将其鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida CGMCC3830。结合单因素及响应面法对该菌株产腈水解酶的发酵条件进行了优化,获得最适培养条件为:甘油13.54 g/L,胰蛋白胨11.59 g/L,酵母粉5.21 g/L,KH2PO4 1 g/L,NaCl 1 g/L,脲1 g/L,初始pH 6.0及培养温度30℃。通过优化,酶活由2.02 U/mL提升至36.12 U/mL。对该菌株底物特异性的考察结果表明,恶臭假单胞菌腈水解酶对芳香族腈类化合物具有较高的水解活力。将其应用于烟酸的生物合成中,2 mg/mL游离细胞能90 min内将20.8 g/L 3-氰基吡啶彻底转化,制备得到相应烟酸。这些结果表明恶臭假单胞菌P.putida CGMCC3830在烟酸的规模化生产中具有一定的应用潜力。     

钝齿棒杆菌丙酮酸激酶的克隆表达及其对精氨酸合成的扰动影响

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA 5-5是诱变选育的一株高产精氨酸菌株。丙酮酸激酶(pyruvate kinase)是EMP途径的限速酶,对胞内能量产生和代谢流调节方面都有重要作用。为提高葡萄糖消耗速率以缩短发酵周期,以钝齿棒杆菌基因组为模板,克隆得到pyk基因并将其在C.crenatum SYPA 5-5中成功表达,葡萄糖平均消耗速率为1.71 g/L/h较C.crenatum SYPA 5-5提高33.5%,精氨酸产量和最大产率分别为43.32 g/L和0.55 g/L/h较C.crenatum SYPA 5-5分别提高20%和19.5%。结果表明,加强表达丙酮酸激酶能增强EMP途径,提高精氨酸产量。     

不同D/L单体比γ-聚谷氨酸的合成与调控

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由L-谷氨酸和/或D-谷氨酸聚合而成的一种聚氨基酸,广泛应用于化妆品、医药等领域。高聚物单体的立体构型会影响产品性质和应用,因此调控γ-PGA中D-谷氨酸/L-谷氨酸单体比(D/L单体比)具有重要意义。前期以谷氨酸棒杆菌为底盘,表达来自于地衣芽孢杆菌的γ-PGA合成酶,合成以L-Glu(97.10%)为主的γ-PGA。通过外源添加不同浓度D-谷氨酸,合成了D-谷氨酸占比为15.71%~33.52%的γ-PGA。然后,在重组菌中表达来自于枯草芽孢杆菌的谷氨酸消旋酶,并使用三个不同强度RBS调控其表达水平,合成D-谷氨酸占比30.82%~34.59%的γ-PGA,但调控范围较窄。利用四个不同强度启动子调控谷氨酸消旋酶表达水平,扩大D/L单体比可调范围,合成D-Glu占比32.71%~52.53%的γ-PGA。提供一种理性调控γ-PGA的D/L单体比策略,实现了D-谷氨酸占比为2.90%~52.53%的γ-PGA的合成,为高效合成不同D/L单体比γ-PGA提供了基础。     

猴头菌粉与5-氨基水杨酸联用抑制小鼠急性溃疡性结肠炎并提高肠道共生菌Parabacteroides distasonis丰度

猴头菌Hericium erinaceus是一种药食同源真菌,广泛应用于治疗胃肠道疾病,可采用液态发酵技术规模化量产获得菌丝体粉。本研究旨在分析猴头发酵菌粉（HE,300mg/kg/d）与5-氨基水杨酸（5-aminosalicylic acid,5-ASA,150mg/kg/d）联用对葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate,DSS）诱导的小鼠结肠炎的治疗作用。HE和5-ASA能够减轻小鼠急性溃疡性结肠炎症状,包括减轻体重的降低率和疾病活动指数评分（DAI）。HE和5-ASA联用可以显著抑制小鼠结肠组织炎症,通过降低肿瘤坏死因子-α（Tnf-α）和白细胞介素-β（Il-β）基因的表达。此外,利用16S rRNA基因测序技术对小鼠盲肠微生物群落组成及结构进行分析。HE与5-ASA联用可以重塑肠道微生态环境,并显著提高狄氏副拟杆菌Parabacteroides distasonis相对丰度。人体粪便体外发酵结果证实HE与5-ASA可以增加P. distasonis。综上,HE与5-ASA联用可有效抑制小鼠结肠炎症水平,并调节肠道微生物,可能是通过增加P. distasonis起作用。     

药食用真菌菌丝提取物的降糖和降脂活性（英文）

药食用真菌是世界公认的具有良好疗效的药食同源物质。然而,其中主要生物活性的成分尚未研究透彻。在本研究中,我们研究了虫草头孢Cephalosporium sinensis、蝙蝠蛾被孢霉Mortierella hepiali、猴头菌Hericium erinaceus、灵芝Ganoderma lingzhi、蜜环菌Armillaria mellea、牛樟芝Antrodia cinnamomea等6种菌丝体的正己烷、氯仿、乙酸乙酯和甲醇提取物的降糖降脂活性。我们通过人类肝癌细胞株Hep G-2建立了胰岛素诱导的胰岛素抵抗模型和油酸(OA)诱导的甘油三酯(TGs)沉积模型,并对24种提取物的降糖降脂活性进行了功能评价。结果表明在无细胞毒性的作用浓度下(300μg/m L),猴头菌和灵芝的正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇提取物以及虫草头孢的正己烷提取物剂量依赖性的增加Hep G-2细胞葡萄糖的消耗;虫草头孢的正己烷、乙酸乙酯、甲醇提取物以及灵芝的正己烷、乙酸乙酯提取物和蝙蝠蛾被孢霉的正己烷提取物剂量依赖性的抑制OA诱导的TGs合成。这些结果表明,药食用真菌可以被用来调控糖脂代谢紊乱。     

氨糖合酶的定向改造及其在氨糖生物合成中的应用

本研究采用基因工程手段克隆表达和定向改造氨糖合酶GLS,并通过共表达氨糖乙酰化酶GNAL进一步增强宿主菌氨糖产生能力。首先通过不同表达质粒和宿主的优化筛选出最优GLS表达体系,成功构建获得E.coli Rosetta-gami(DE3)-p ET-24a-GLS工程菌,检测其氨糖Glc N产量为1.63 g/L。为提升重组酶的转化能力,采用易错PCR技术对氨糖合酶进行非理性改造,通过高通量筛选方法从2 700余株克隆的文库中筛选获得一株高产Glc N的突变株,其产量达到3.57 g/L,相比出发菌株提高1.19倍。由于Glc N的积累对于氨糖合酶重组菌生长及代谢活动具有一定的抑制作用,本研究进一步通过共表达氨糖乙酰化酶GNAL,将Glc N部分转化为乙酰化氨糖Glc NAc,减少产物的抑制效应,结果表明GNAL与GLS串联表达能显著提升菌株的转化能力,Glc N及Glc NAc累积产量达到7.83 g/L,比单独表达GLS时提升2.19倍。经过初步摇瓶发酵优化,在5 L发酵罐上最高产量达到9.85 g/L。本研究从GLS的改造策略出发,通过易错PCR非理性改造的方式提升了GLS对于产物氨糖的耐受性,增强了GLS合成氨糖的能力,为进一步提升大肠杆菌发酵合成氨糖能力奠定基础。     

低分子质量魔芋甘露寡糖的长期毒性与遗传毒性研究

魔芋甘露寡糖是一种具有肠道菌群调节作用的新型食品添加剂．本研究首次通过酶解与有机溶剂沉淀法制备了低分子质量的甘露寡糖(聚合度2～7),并对这类寡糖进行了长期毒性与遗传毒性评价．在长期毒性试验中,以大鼠为实验对象,分低、中、高(2.25,5.25,7.50 g/kg)药物剂量组和阴性对照组,连续灌胃给药90天．一般状况观察、生化指标、血液学指标、病理学等与对照组比较均无显著性差异,而大体解剖观察发现,部分大鼠的肝脏与肾脏形态发生变化,但这些变化均在正常范围内,且其他各项指标差异均无统计学意义．此外,一系列实验包括小鼠骨髓微核实验、Ames试验、小鼠精子畸变试验均未发现低分子质量甘露寡糖有明显的遗传毒性．试验结果提示,本研究方法获得的低分子质量甘露寡糖在本实验条件下未发现长期毒性与遗传毒性．     

高通量测序技术在食品微生物研究中的应用

高通量测序技术的快速发展对食品微生物发酵过程和机制研究产生了深刻的影响,主要体现在食品微生物生理功能、代谢能力和进化的研究以及食品微生物群落结构、动态变化及其对环境的响应机制等方面。另外,通过对食品微生物基因组和元基因组进行数据分析,也对食品发酵过程优化、微生物功能改造、食源性微生物疾病预防和控制等提供了重要的依据。本文总结了近年来利用高通量测序技术对食品微生物基因组和元基因组进行测序的研究,并探讨了测序技术的发展对食品微生物研究的影响及发展趋势。     

泸型酒酒醅中梭菌群落的发酵演替规律和功能预测

【目的】研究泸型酒酒醅中梭菌(Clostridia)群落的演替规律,探讨梭菌群落在酒醅发酵过程中的潜在功能。【方法】利用实时荧光定量PCR技术结合高通量测序技术研究不同发酵时间泸型酒酒醅中梭菌丰度变化;通过梭菌16S r RNA基因序列高通量测序数据分析揭示梭菌群落演替规律,并运用LEf Se分析找出标志性OTU;通过PICRUSt分析对梭菌功能组成进行预测。【结果】泸型酒发酵过程酒醅中梭菌的生物量在发酵14 d上升至最高(3.46×10~7 copies/g),梭菌占总细菌的相对丰度在发酵20 d达到最高(6.67%);对梭菌群落结构的聚类分析结果表明,发酵7 d的酒醅梭菌群落结构显著区别于其他发酵时间,主要体现为存在17个标志性OTU,其中大部分分类学地位尚不明确;PICRUSt分析显示梭菌主要参与氨糖与核糖代谢、磷酸戊糖途径,其次是果糖和甘露糖代谢、TCA循环、糖酵解途径、丙酸及丁酸代谢。【结论】泸型酒酒醅中梭菌的生物量和占细菌的相对丰度在发酵开始后的2-3周内逐渐达到最高,而梭菌群落的结构则在发酵1周内便发生了显著改变,并在发酵2-3周内趋于稳定。在发酵2-3周时有较多与丙酸、丁酸等风味物质代谢相关的基因在酒醅梭菌中被预测到。