腈水解酶psn基因工程菌的发酵及产酶条件优化

来自恶臭假单胞菌的腈水解酶具有高效催化3-氰基吡啶产烟酸的能力,对表达该酶的基因psn进行发酵和产酶条件优化,通过对C源、N源、磷酸盐、金属离子、温度、诱导剂浓度和诱导时间进行单因素考察,获得最适培养基条件(g/L):葡萄糖5、蛋白胨15、酵母粉5、(NH4)2SO45、K2HPO424.5、KH2PO45.76、MgSO40.48;最佳诱导条件:培养2.5 h后添加IPTG诱导,浓度0.2 mmol/L,诱导温度30℃。在该条件下培养,重组大肠杆菌的腈水解酶比酶活可达到45.67 U/mL,比优化前提高了2.26倍。在此基础上,于5 L发酵罐上进行C、N源的补料研究,获得最适分批补料策略,发现其腈水解酶活力可达到75.40 U/mL,是优化前的3.74倍。     

一株烟酸羟基化转化菌株的筛选和鉴定

从南京地区的土壤中筛选到一株高效转化烟酸为 6_羟基烟酸的菌株NA_1。形态及生理生化特征测定结果表明 ,NA_1菌株与假单胞菌属 (Pseudomonas)中的恶臭假单胞菌 (P .putida)种的特征基本一致。测定了该菌株的16SrDNA序列并根据 16SrDNA构建了系统发育树 ;在系统发育树中 ,NA_1菌株与恶臭假单胞菌形成一个类群 ,序列同源性为 99%。因此将NA_1菌株鉴定为恶臭假单胞菌     

Pseudomonas putida S1海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的克隆表达

利用PCR和TA克隆方法扩增和克隆得到了恶臭假单胞菌Pseudomonas putida S1的海藻糖合成酶基因treS.对其进行序列分析表明,其编码区含有2067bp,编码含688个氨基酸残基的蛋白质,其核苷酸序列和蛋白质序列与来源于其它假单胞菌属细菌的海藻糖合成酶的序列表现出了较高同源性.将该基因序列与表达载体pQE30T连接,构建重组质粒pQE30T-TS,并将其转化至E.coli M15菌株中.重组菌株经诱导表达后SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示有明显的分子量约77.5kD的特异蛋白条带出现.经测定酶活力达19U/mL,约是原始菌株P.putida S1的50倍.     

恶臭假单胞菌NA_1菌株烟酸羟基化酶活性的诱导和转化条件的研究

恶臭假单胞菌NA_1菌株的培养和产酶特性与已报道的产酶菌株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens) IFO 12648和荧光假单胞菌(Psudomonas fluorescens) TN5有所不同, 主要反映在最适碳源及浓度、最适诱导剂浓度和最适培养温度等方面。最适的转化条件是温度为30℃,pH为7.0, 烟酸的浓度为3％。采用初步优化后的条件和流加底物的方式进行4L上罐生产,恶臭假单胞菌NA_1菌株的6_羟基烟酸产率可达到108.39g/L。     

Arthrobacter nitroguajacolicus腈水解酶基因的克隆和表达

腈水解酶是一类能将腈类化合物催化生成酸的氰基水解酶。目前已有多个菌种的腈水解酶基因序列被报道,如敏捷食酸菌Acidovoraxfacilis,粪产碱菌Alcaligenesfaecalis,睾丸丛毛单胞菌Comamonastestoteroni,肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae,假单胞菌Pseudomonas属菌株,红球菌Rhodococcus属菌株,但节杆菌属菌株Arthrobacternitroguajacolicus的腈水解酶基因序列尚未见报道。经由野生型酶的分离纯化,基因文库筛选及侧翼序列扩增等步骤,克隆得到该菌株的腈水解酶基因,从而为进一步研究该酶的特性及构建用于工业生产的重组菌打下基础。     

羟基乙腈水解酶菌株的筛选及其催化特性

以羟基乙腈为唯一氮源, 从土壤中筛选到一株腈水解酶产生菌CCZU-12, 经形态观察生理生化实验和16S rDNA序列分析, 鉴定该菌为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。对菌株CCZU-12产腈水解酶的培养条件及催化反应条件进行优化, 最适产酶培养条件为: 碳源为10 g/L乙酸钠, 氮源为5 g/L酵母粉, 金属离子为1.0 mmol/L Mg2+, 培养温度30 °C, pH值7.0, 接种量4%, 装液量50 mL/250 mL; 最适催化反应温度35 °C, pH值7.0, 反应120 h, 羟基乙腈转化率达到98.9%。     

恶臭假单胞菌NA-1菌株烟酸羟基化酶活性的诱导和转化条件的研究

恶臭假单胞菌NA-1菌株的培养和产酶特性与已报道的产酶菌株粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)IFO12648和荧光假单胞菌(Psudomonasfluorescens)TN5有所不同,主要反映在最适碳源及浓度、最适诱导剂浓度和最适培养温度等方面。最适的转化条件是温度为30℃,pH为7.0,烟酸的浓度为3%。采用初步优化后的条件和流加底物的方式进行4L上罐生产,恶臭假单胞菌NA-1菌株的6-羟基烟酸产率可达到108.39gL。     

一株产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的氢氧化细菌的分离鉴定及酶活力测定

[目的]以结瘤豆科植物紫花苜蓿根际土壤为研究材料,筛选具有ACC脱氨酶活力的氢氧化细菌,探索氢氧化细菌植物促生作用机制.[方法]利用持续通H2 的气体循环培养体系、矿质盐固体培养基,分离、培养氢氧化细菌,观察菌株形态并测定生理生化特征;16S rDNA序列分析法构建系统发育树;采用薄层层析法筛选ACC脱氨酶阳性菌株,茚三酮显色法测定ACC脱氨酶活力.[结果]分离的37株细菌中有8株菌氧化氢和自养生长能力较强,初步确定为氢氧化细菌,从中筛选出1株ACC脱氨酶阳性菌株WMQ-7.菌株WMQ-7的形态特征、生理生化特征与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的特征基本一致;16s rDNA序列(GenBank登录号为EU807744)在系统发育树中与恶臭假单胞菌同属一个类群,序列同源性99%.鉴定菌株WMQ-7为恶臭假单胞菌,其ACE脱氨酶活力为0.671 U/μg[结论]采用气体循环培养体系分离氢氧化细菌,克服了传统配气法的局限.ACC脱氨酶阳性菌株的筛选,为深入研究氢氧化细菌作为植物根际促生菌的菌株特性和促生机制提供理论依据.     

活性污泥中Fe(Ⅲ)还原微生物的分离、鉴定及还原特性

采用平板分离法和柠檬酸铁还原实验法相结合,从城市污水处理厂活性污泥中分离获得Fe(Ⅲ)还原菌F7,经形态观察、生理生化和16S rDNA序列分析及同源性比对鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida).在不同柠檬酸铁浓度和不同pH条件下的实验表明,柠檬酸铁浓度为0.32g/L时,菌株生长情况较好,柠檬酸铁浓度为0.16g/L时,Fe(Ⅲ)异化还原比例较高;pH6.5时,菌株生长情况较好,Fe(Ⅲ)异化还原量较多.     

外源质粒电击转入Pseudomonas putida的条件研究

以自行筛选的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）(命名为Rs198,Genbank登录号为FJ788425）为受体菌,将具有卡那霉素抗性标记的大肠杆菌假单胞菌穿梭质粒PDSK519通过电转化法导入到受体菌中,对细胞生长状态、电转化温度、质粒DNA及感受态细胞浓度、电击电压及电转化介质给予转化效率的影响进行研究。结果表明,在细胞生长至OD600为0.5左右时收集菌体,在低温条件下制备浓度为 4.6×1012/ml 的感受态细胞,以0.3mol/L的蔗糖为电转化介质,在13kV/cm的场强下电击能获得较高的转化效率,最高可达1.3×107个转化子/μ g DNA。为构建恶臭假单胞的遗传转化系统,利用基因工程手段为该菌的进一步研究奠定了理论基础。     

(3R)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解酶产生菌的筛选与产酶条件优化

以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为唯一碳源,采用手性气相法检测,筛选到一株能产对映选择性水解酶的假单胞菌Pseudomonas CGMCC No.4184.该菌产的水解酶能优先水解R型底物产生(3R)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸,产物对映体过量值达到90%以上.对菌株Pseudomonas CGMCC ...     

产γ-谷氨基甲酰胺合成酶菌株的筛选及产酶条件研究

以假单胞菌(Pseudomonas sp.)为出发菌株,通过紫外诱变筛选得到一株γ-谷氨基甲酰胺合成酶高产菌株UV-19,其酶活提高32.54%。以突变株UV-19为供试菌株,对γ-谷氨基甲酰胺合成酶的发酵条件进行优化。首先利用Plackett-Burman设计筛选出影响较大的4个因素:葡萄糖、蛋白胨、起始pH值、装液量。在此基础上再利用CCD响应面分析法进行优化,得到最佳产酶培养条件为(g/L):葡萄糖15、蛋白胨12、NaCl 5.0、MgSO4.7H2O 0.2、K2HPO4.3H2O 0.5、甲胺盐酸盐1.0g/L、起始pH值6.5、装液量72mL/250mL。该优化条件下进行产酶培养,假单胞菌发酵产γ-谷氨基甲酰胺合成酶酶活力可达32.68U/mL。     

酶促生物转化丙酮酸生产的研究

建立了一种利用琥珀酰亚胺代谢从延胡索酸生产丙酮酸的新工艺。经诱变得到恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida 15160)的缬氨酸或(与)亮氨酸营养缺陷型变异株M29,该菌株在最优条件下作用72h将1mol／L延胡索酸转化成为821mmol／L丙酮酸。     

猪笼草中产蛋白酶内生菌的分离及鉴定

采用研磨法分离纯化猪笼草各组织器官中的内生菌,并采用水解圈法和摇瓶发酵法分别进行初筛与复筛,对筛选出的菌株进行16SrDNA分析鉴定。结果表明:在猪笼草叶片、捕虫囊、根和茎等4种器官中共分离出25株内生菌;进一步从中筛选出2株可产胞外蛋白酶的细菌A3、L5,其中菌株A3的产酶能力较高,水解圈/菌落直径比(D/d)值为6.5,发酵液的蛋白酶活力为17.58U/mL;菌株L5的D/d值为3.0,发酵液的蛋白酶活力为15.77U/mL;16SrDNA鉴定结果表明,菌株A3、L5与芽孢杆菌属成员具有99%的同源性,其中A3是枯草芽孢杆菌(Ba-cillus subtilis),L5可能是其的新变种或新亚种。     

D-泛酸高产菌株C21的筛选及鉴定

从10个植物根际土样中分离出315株根际微生物,然后采用泛酸测定平板初筛和摇瓶复筛的方法,从中筛选到7株D-泛酸高产菌株,其中从菜豆根际土壤分离到的菌株C21的D-泛酸产量最高,达到24.1mg/L。最后通过形态和生理生化特性以及16SrDNA鉴定,确定菌株C21为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。     

苯扎贝特降解菌的筛选及降解特性

【目的】药品苯扎贝特在水环境中频繁检测出,对环境的潜在危害不容忽视。我们筛选分离降解苯扎贝特的细菌,并研究其降解特性。【方法】根据分离菌株的细胞形态结构、生理生化特征及其16S rRNA基因序列分析鉴定降解菌,高效液相色谱法测定苯扎贝特,以判定该菌株的降解能力。【结果】分离菌株B-31属恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),降解机制是共代谢。降解最佳条件为30℃、pH7。此条件下,以1%甲醇为初级基质,30mg/L苯扎贝特的5日降解率为48%。当分别以5g/L葡萄糖、蛋白胨、酵母粉为初级基质时,可使降解率提高到61%,、72.6%、76.67%。【结论】这是国内首次报道恶臭假单胞菌可以通过共代谢降解苯扎贝特,该研究为利用细菌发酵消除水环境中苯扎贝特污染提供基础。     

假单胞菌株K9510产肌酐酰氨基水解酶的条件

肌酐酰氨基水解酶是酶法分析血清肌酐浓度的关键酶。本实验室从空气中分离到能分解肌酐的菌株K9510,K9511和K9512,其中K9510菌株初步分类鉴定为假单胞菌（Pseudomonas sp.)。菌株产酶条件优化研究结果表明：菌株在底物或底物类化物的诱导下产酶;混合金属离子溶液对菌株产酶有促进作用,菌株产肌酐酰氨基水解酶是适培养基组成为：肌酐9克,酵母提取物1．5g,麦芽汁0．9g,NH4Cl0.5g,定容1L。适量混合金属离子溶液,用0．1mol/L pH5.5磷酸缓冲液配制.。在250mL三角瓶中装50mL培养基,在250r/min的旋转摇床上35度振荡培养33h,在此条件下菌株产酶量可达1．0u/mL发酵液。     

产腈水解酶菌株的诱变及培养优化

对实验室保存的1株产腈水解酶的Rhodococcus rhodochrous菌株采用氯化锂进行诱变处理,筛选得到了1株产酶活力较高的菌株tg1-A6。经过优化得到培养基的配方为(g.L-1):葡萄糖10,谷氨酸钠10,酵母膏3,己内酰胺7,MgSO40.5,K2HPO40.75,KH2PO40.75。当培养温度28℃,摇床转速200 r.min-1,初始pH值7.0,通过补加葡萄糖,该菌的腈水解酶酶活可达到26.77 U.mL-1。     

假单胞菌属No.2120生产D-甘露糖异构酶发酵培养基的优化

通过单因子实验、Plackett-Burman实验设计、响应面分析法对假单胞菌属No.2120产D-甘露糖异构酶的培养基进行优化,确定发酵优化条件:果糖15.26 g/L,牛肉膏20 g/L,酵母膏2 g/L,K2HPO42 g/L,MgSO4.7H2O0.5 g/L,NaCl 0.5 g/L,Tween-80 1.54 g/L。采用优化配方异构酶比酶活可以达到68.28 U/mL。     

一株苯酚降解菌的鉴定及其降解特性

【目的】鉴定从某化工厂附近土样中分离到的一株耐高浓度苯酚的菌株T10,通过优化菌株的培养条件提高菌株对苯酚的降解率。【方法】根据菌株的形态、生理生化鉴定及16S rDNA测序分析确定其种属,以液体摇瓶培养菌株T10对苯酚的降解率为指标,对菌株的生长条件进行优化。【结果】菌株T10属恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。添加葡萄糖、蛋白胨能有效缩短T10菌的生长周期,并使苯酚的降解率提高1.7倍。在菌体初始接种浓度为10%、温度为30°C、转速为180 r/min条件下,对初始苯酚浓度、pH和装液量的响应面优化结果如下:初始苯酚浓度3 000 mg/L、pH 7.5和装液量80 mL/250 mL,苯酚去除率最高可达到87.56%。【结论】T10菌能够耐受较高浓度的含酚废水,并且对苯酚有较强的降解能力,为下一步利用生物法处理含酚废水提供科学依据。