甾体生物转化技术研究的现状与进展

从半合成原料、菌种选育及改良和生物转化新技术与新工艺(包括底物的物理/化学助溶法,新型转化体系和细胞通透性改良法)等方面对近几年来甾体生物转化进展进行综述。可以预测,在甾体药物的工业化生产过程中,生物转化技术所占比例将大幅度提高。     

L-精氨酸发酵研究进展

概述了Ｌ－精氨酸的生物合成途径、调节机制、选育方案以及国内外的研究概况。     

细菌木聚糖酶高产菌的选育及产酶条件

木聚糖是一种在植物体内大量存在的半纤维素,是在自然界中含量仅次于纤维素的一种可再生植物纤维。木聚糖酶(ｘｙｌａｎａｓｅ,ＥＣ3.2.1.8)是一类能够特异降解木聚糖的酶类。近年来,人们将其广泛用于造纸工业的纸浆生物处理,与其他消化酶类一起用作饲料添加剂,以及应用于食品加工工业和纺织工业等。木聚糖酶可以由许多种微生物产生[1],我国多集中于霉菌木聚糖酶的研究。本文报告了一株细菌木聚糖酶产生菌的筛选及产酶条件的研究结果。1　材料和方法11　菌株本实验室分离、保存的木聚糖酶产生菌ＷＸＵＬＩ11及其突变株ＷＬＵＮ024。12　培养…     

III型类人胶原蛋白在大肠杆菌重组表达及发酵制备

【背景】胶原蛋白广泛应用于日用化工及生物医药中,相比传统方法,基因工程方法制备胶原蛋白具有避免病毒隐患、产量高等优点,逐步受到广泛关注。【目的】获得III型类人胶原蛋白基因,实现大肠杆菌中的异源表达。【方法】以人III型胶原蛋白α1链为模板,(Gly-X-Y)为最小研究单位,优选亲水性氨基酸,设计目标基因kit,构建重组大肠杆菌(Escherichia coli) pET-28a(+)-kit/BL21(DE3),并对其结构进行表征。【结果】类人胶原蛋白基因kit成功在大肠杆菌体系中表达,表达量约为0.53 g/L,7 L发酵罐上补料发酵后其最大表达量提高至3.02 g/L,亲和层析纯化类人胶原蛋白纯度约为91%,对其进行N端测序、氨基酸分析、质谱分析及圆二色谱分析,确定类人胶原蛋白成功表达。【结论】类人胶原蛋白的成功表达为未来规模化制备及其在日用化工及生物医药行业的应用奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌突变株XLG-51产中温α-淀粉酶发酵条件优化

通过单因素实验和响应面分析对枯草芽孢杆菌XLG-51产中温α-淀粉酶的发酵产酶条件进行优化,实验结果表明:(1)种子最佳接种时间为对数后期(种龄20 h);(2)玉米粉和豆饼粉为发酵培养的最佳碳氮源;(3)通过对C/N(玉米粉:豆饼粉)、接种量和发酵液初始p H值这3个关键因素进行三因素三水平的响应面实验设计,优化得枯草芽孢杆菌XLG-51产中温α-淀粉酶的最优发酵条件为:C/N为3.76∶1,接种量为10.46%,初始发酵p H为6.54。经过三批次发酵实验验证,最优条件下产酶活性提高至6 897 U/m L,发酵周期缩短至66 h,生产强度达到104.5 U/(m L·h),较优化前提高27.3%。     

Gibberella intermedia CA3-1羟基化去氢表雄酮的工艺

利用Gibberella intermedia CA3-1对甾体化合物去氢表雄酮(DHEA)进行C7α-羟基化反应研究。用单因素实验的方法考察接种量、装液量、转速、有机溶剂助溶、投料浓度以及底物投加时间对产物7α-羟基去氢表雄酮(7α-OH-DHEA)生成的影响。最终确定最适工艺条件:接种量6%,装液量30 m L(250 m L三角瓶),转速220 r/min,体积分数6%丙二醇助溶,接种时即添加底物,底物DHEA质量浓度1 g/L,转化时间36 h。采用优化后的转化条件,7α-OH-DHEA摩尔得率为72.34%。     

Qβ噬菌体RNA复制酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

构建了带有Qβ噬菌体RNA复制酶cDNA基因的重组表达质粒pKK-Rep,采用电泳分析的方法考察了不同浓度的IPTG、不同的葡萄糖浓度对pKK-Rep在E.coli JM109中表达RNA复制酶蛋白的影响。结果表明,0.01mmol/L IPTG可以有效诱导pKK-Rep表达RNA复制酶蛋白,但表达的RNA复制酶蛋白大多数为不溶性蛋白。在培养基中添加0.02%的葡萄糖对该RNA复制酶蛋白的组成型表达无明显的影响,但当葡萄糖浓度增加至0.04%-1.0%时,这种组成型表达量显著降低。采用MDV－poly( )RNA作为模板来体外检测可溶性表达蛋白的活性,结果表明其具有体外特异扩增RNA模板的活性。     

高效转化植物甾醇为9α-OH-AD的分枝杆菌诱变选育及工艺优化

以实验室前期筛选得到的分枝杆菌(Mycobacterium sp.LY-1)为出发菌株,采用等离子诱变(ARTP)技术选育出能高效转化植物甾醇为重要甾体药物中间体9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)的菌株,并对其转化工艺进行优化。经过ARTP诱变选育得到遗传稳定性较好的分枝杆菌突变株Mycobacterium sp.C33,当底物植物甾醇投料浓度为15 g/L时,转化生成9α-OH-AD的摩尔得率达到15.5%,较原始菌株提高34.8%。继而采用正交实验设计方法,对突变菌的发酵培养基组分进行优化,并建立了油水双相转化体系,进一步提高了突变菌株C33的产物摩尔得率,最高达到47.0%,较优化前(15.5%)提高了2倍。     

基于宏基因组学解析不同质量等级中温大曲微生物组的异质性

【目的】中温大曲是浓香型白酒酿造中的糖化发酵剂和生香剂，目前其质量评价主要依赖于感官和理化特征。已有研究采用扩增子测序初步探索了大曲质量等级与微生物群落组成之间的关联性，但是微生物群落功能对大曲质量的影响尚缺乏深入研究。【方法】本研究采用宏基因组学解析和对比了不同质量等级大曲的微生物群落组成和潜在功能的差异，结合理化性质，聚焦分析了酶活、乳酸和乙酸代谢相关的关键酶基因丰度。【结果】两种等级大曲的真菌群落组成差异显著。一级大曲含有更高相对丰度的丝状真菌，主要分布在曲霉属(Aspergillus, 21.6%)、罗萨氏菌属(Rasamsonia, 6.8%)、拟青霉属(Paecilomyces, 5.0%)和篮状菌属(Talaromyces, 4.4%)等。一级大曲中与环境信息处理和细胞过程相关途径的基因相对丰度普遍显著高于二级大曲。一级大曲中薄层菌属(Hymenobacter)和曲霉属等提供了更高基因丰度的α-淀粉酶，使其具有显著较高的液化力。二级大曲则含有更高相对丰度的横梗霉属(Lichtheimia, 11.8%)、根霉属(Rhizopus, 13.4%)和毕赤酵母属(Pichia, 7.2%)以及乳酸菌类微生物，如伴生乳杆菌属(Companilactobacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)和黏液乳杆菌属(Limosilactobacillus)等。二级大曲中与代谢相关途径的基因相对丰度显著较高，如碳水化合物代谢、能量代谢和核苷酸代谢等。二级大曲中较多的乳酸菌类群有利于提高乙醇脱氢酶基因丰度，同时，糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、曲霉属和高温放线菌属(Thermoactinomyces)等提供了更多的羧酸酯酶基因丰度，分别使其具有较高的发酵力和酯化力。此外，二级大曲中较多的乳酸菌还可能产生更多的乳酸脱氢酶，降解乳酸，且更高基因丰度的乙酸代谢相关酶类可促进乙酸分解代谢，使得二级大曲酸度显著低于一级大曲。【结论】本研究在基因水平上研究了不同质量等级大曲酶活和酸度差异的微生物基础，可为建立完善的大曲质量评价体系以及理性地调控群落功能提供理论支撑。