氨糖合酶的定向改造及其在氨糖生物合成中的应用

本研究采用基因工程手段克隆表达和定向改造氨糖合酶GLS,并通过共表达氨糖乙酰化酶GNAL进一步增强宿主菌氨糖产生能力。首先通过不同表达质粒和宿主的优化筛选出最优GLS表达体系,成功构建获得E.coli Rosetta-gami(DE3)-p ET-24a-GLS工程菌,检测其氨糖Glc N产量为1.63 g/L。为提升重组酶的转化能力,采用易错PCR技术对氨糖合酶进行非理性改造,通过高通量筛选方法从2 700余株克隆的文库中筛选获得一株高产Glc N的突变株,其产量达到3.57 g/L,相比出发菌株提高1.19倍。由于Glc N的积累对于氨糖合酶重组菌生长及代谢活动具有一定的抑制作用,本研究进一步通过共表达氨糖乙酰化酶GNAL,将Glc N部分转化为乙酰化氨糖Glc NAc,减少产物的抑制效应,结果表明GNAL与GLS串联表达能显著提升菌株的转化能力,Glc N及Glc NAc累积产量达到7.83 g/L,比单独表达GLS时提升2.19倍。经过初步摇瓶发酵优化,在5 L发酵罐上最高产量达到9.85 g/L。本研究从GLS的改造策略出发,通过易错PCR非理性改造的方式提升了GLS对于产物氨糖的耐受性,增强了GLS合成氨糖的能力,为进一步提升大肠杆菌发酵合成氨糖能力奠定基础。     

壳寡糖对大肠杆菌抑菌活性研究

分析壳寡糖对大肠杆菌抑菌效果的影响因素.采用摇瓶法和ELISA板法对不同浓度的壳寡糖进行抑菌试验;比较不同pH、不同脱乙酰度的壳寡糖对大肠杆菌抑菌效果的差异;比较不同聚合度的单一聚合度壳寡糖抑菌效果的差异.壳寡糖浓度大于5 mg/mL时抑菌效果与同浓度苯甲酸钠相近;pH为4时,0.156 mg/mL的壳寡糖溶液抑菌活性即能超过90%;pH为7时,5 mg/mL的壳寡糖才能达到90%抑菌活性.脱乙酰度为95%时,5 mg/mL的壳寡糖溶液抑菌活性能超过97%;脱乙酰度为45%时,40 mg/mL的壳寡糖溶液抑菌活性仅有56%;聚合度大于4的单一聚合度壳寡糖40 mg/mL时抑菌活性能达到99%.结果表明:提高壳寡糖溶液浓度、降低pH、提高脱乙酰度,能提高壳寡糖的抑菌活性,单一聚合度壳寡糖聚合度越高,对大肠杆菌的抑制作用越强.此外,采用ELISA板的方法进行实验,即节省试药又方便快捷.