H7N9禽流感病毒野生或突变神经氨酸酶对奥司他韦及扎那米韦敏感性的研究

本文研究了野生和突变H7N9禽流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)对奥司他韦羧酸盐及扎那米韦的敏感性。将密码子优化的H7N9(A/Hangzhou/1/2013)病毒神经氨酸酶DNA克隆到pcDNA3.1/His载体(简称NAH7N9-WT质粒)后,将该质粒转染293T细胞,48h后裂解收集上清液,得到野生型H7N9神经氨酸酶。利用一步PCR突变法,在NAH7N9-WT质粒中引入H274Y和R292K突变(NA以N2编号),简称NAH7N9-H274Y、NAH7N9-R292K质粒,测序确认正确后将两种突变质粒转染293T细胞,48h后裂解收集上清液,获得突变H7N9神经氨酸酶。Western blot鉴定野生和突变NA的表达。以4-MUNANA为底物检测野生及突变NA活性,检测奥司他韦羧酸盐和扎那米韦对野生及突变NA的抑制活性。结果显示,野生及突变NA质粒转染细胞后均获得了分子量约为70kD的目标蛋白,但H274Y突变酶的表达量显著低于野生酶及R292K突变酶;所表达的NAH7N9-WT、NAH7N9-H274Y和NAH7N9-R292K均有活性;奥司他韦羧酸盐对NAH7N9-WT、NAH7N9-H274Y和NAH7N9-R292K的半数抑制浓度分别为1.6nM、15.1nM和大于1 000nM,耐药倍数分别为9和大于625倍;扎那米韦对NAH7N9-WT、NAH7N9-H274Y和NAH7N9-R292K的半数抑制浓度分别为1.1nM、1.4nM和38.0nM,耐药倍数分别为1.3和34倍。本研究结果表明奥司他韦和扎那米韦可显著抑制NAH7N9-WT活性,NAH7N9-R292K对奥司他韦和扎那米韦有显著的耐药性(耐药倍数34~625倍),NAH7N9-H274Y对奥司他韦和扎那米韦敏感(耐药倍数1~9倍)。结果提示,临床感染H7N9的患者可用扎那米韦或奥司他韦治疗,但当该病毒发生NAH7N9-R292K突变时,建议停止使用这两种药物。     

胰蛋白酶工程研究进展

胰蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶家族,由223个氨基酸残基组成,在胰腺泡组织中表达。牛、猪、鼠胰蛋白酶的氨基酸序列表现出广泛的同源性。     

近交系BALB/c小鼠及先天遗传性白内障突变型BALB/cBk-Cat小鼠的DNA指纹研究

采用人工合成的寡核苷酸探针(GATA)~4|分别与近交系小鼠BALB/c和经10年 30代培育而成的自发突变型近交系先天遗传性白内障BALB/cBk-Cat小鼠进行DNA分杂交,DNA指纹显示:(1)BALB/c小鼠个体之间以及BALB/cBk-C at小鼠个体之间没有差异;(2)BALB/c小鼠与BALB/cBk-Cat小鼠的DNA指纹在23-6kb之间的区域有差异。     

近交系BALB/c小鼠及先天遗传性白内障突变型BALB/cBk-Cat小鼠的DNA指纹研究

采用人工合成的寡核苷酸探针(GATA)~4|分别与近交系小鼠BALB/c和经10年 30代培育而成的自发突变型近交系先天遗传性白内障BALB/cBk-Cat小鼠进行DNA分杂交,DNA指纹显示:(1)BALB/c小鼠个体之间以及BALB/cBk-C at小鼠个体之间没有差异;(2)BALB/c小鼠与BALB/cBk-Cat小鼠的DNA指纹在23-6kb之间的区域有差异。     

激光诱变家蚕突变及其遗传育种的研究

本文报道了激光诱导家蚕单性生殖五年（１９８９—１９９３）来的研究结果。由于家蚕雌雄核受刺激的敏感性存在着差异,激光刺激不仅能使未受精的处女蛾卵发育产生孤雌生殖;而且能够破坏交配蛾卵的雌核发育产生孤雄生殖。试验结果说明激光诱发家蚕单性生殖具有明显效果,现已选育成“单性１号”和“单性２号”两个新突变体及其优良杂交组合“单性１号×皖５”和“单性１号×中８”,由于“单性１号”是斑纹限性品种,用它作母本的杂交种可为蚕业生产带来很大的经济效益。     

突变型环酰亚胺水解酶的底物专一性

摘要 目的：研究环酰亚胺水解酶（CIH293）C-末端区残基对其底物专一性的影响。方法：通过缺失或替代获得了环酰亚胺水解酶C-末端剔除2个或3个氨基酸残基及C-末端两个Lys替代为两个Glu的突变型酶CIH291、CIH290以及KK292,293EE,用比色法与高效液相色谱法分析了重组野生型酶与突变型酶的底物专一性和动力学参数。结果：突变型酶与野生型酶相比,底物专一性未发生显著改变,最适底物仍为琥珀酰亚胺,然突变型酶对最适底物的亲和力略有降低,导致反应速度减小。结论：环酰亚胺水解酶（CIH293）C-末端区残基的改变对其底物专一性的影响不大,但影响了酶对底物的亲和力。     

吉非替尼治疗EGFR突变型晚期肺腺癌的近期疗效、毒副反应及疗效的影响因素分析

摘要 目的：探讨吉非替尼治疗表皮生长因子受体（EGFR）突变型晚期肺腺癌的近期疗效、毒副反应及疗效的影响因素。方法：选取2018年4月~2019年6月期间我院收治的EGFR突变型晚期肺腺癌患者97例。所有患者均给予吉非替尼治疗,观察其近期疗效及毒副反应情况。采用单因素和多因素 Logistic回归分析疗效的影响因素。结果：97例患者全部如期完成治疗,近期疗效评价：完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、病情稳定（SD）、病情进展（PD）率分别为9.28%（9/97）、24.74%（24/97）、31.96%（31/97）、34.02%（33/97）。根据近期疗效结果将患者分为有效组（CR+PR,n=33）和无效组（SD+PD,n=64）。本研究中患者的毒副反应多为 I、Ⅱ度非血液学毒性,最常见的是皮肤毒性,如皮疹等;其他毒副反应如胃部不适、腹泻等,经对症治疗后均能缓解。单因素分析结果显示,吉非替尼治疗EGFR突变型晚期肺腺癌的疗效与性别、肿瘤临床分期、骨转移、肿瘤直径有关（P<0.05）,而与年龄、肾上腺转移、脑转移、吸烟史无关（P>0.05）。多因素Logistic回归分析结果显示,性别为男性、肿瘤分期Ⅳ期是影响吉非替尼治疗EGFR突变型晚期肺腺癌疗效的危险因素（OR=1.473、2.042,P<0.05）。结论：吉非替尼治疗EGFR突变型晚期肺腺癌具有不错的近期疗效,不良反应较少,性别为男性、肿瘤分期Ⅳ期是影响吉非替尼治疗EGFR突变型晚期肺腺癌疗效的危险因素。     

肌间刺缺失对斑马鱼骨骼发育的影响

利用斑马鱼(Danio rerio)野生型与肌间刺完全缺失突变型个体, 从骨骼染色和骨骼发育相关基因表达两方面, 初步评价了肌间刺缺失对斑马鱼骨骼发育的影响。通过骨骼染色对比观察了两种肌间刺表型个体受精后8dpf(days post fertilization, dpf)到56dpf的骨骼发育情况, 结果显示, 两种肌间刺表型除肌间刺外, 其他骨骼发育基本同步。此外, 通过qRT-PCR实验检测分析了6个骨骼发育相关基因(bmp2a、bmp4、smad1、smad4a、runx2a和sp7)在不同肌间刺表型5个胚胎发育时期(3hpf囊胚期、6hpf原肠胚期、12hpf体节期、24hpf咽囊期和72hpf孵化期)和5个胚后生长阶段(15、30、45、60和75dpf)的表达情况。结果显示:在胚胎发育时期, 野生型和突变型个体中bmp2a、bmp4、smad1、smad4a基因和突变型个体中sp7基因的表达均呈现先升后降的变化趋势, 且在体节期达到最高表达水平;野生型和突变型个体中runx2a基因和野生型个体中sp7基因则表现为逐渐上升的趋势。6个基因在囊胚期和原肠胚期表达量无显著差异, bmp2a的表达水平在体节期、咽囊期和孵化期无显著差异, 野生型个体bmp4、smad1、smad4a、runx2a基因在体节期、咽囊期和孵化期的表达水平明显高于突变型, 而sp7基因则表现为突变型明显高于野生型。胚后发育阶段 6个基因在5个生长阶段均呈现逐渐下降的趋势, 且在两种肌间刺表型间其表达仅在个别时期差异显著。综上所述, 肌间刺的缺失对斑马鱼骨骼发育表现型无显著影响, 只在胚胎发育时期影响骨骼相关基因表达水平的变化;结合骨骼染色结果, 推测肌间刺缺失对斑马鱼骨骼发育无显著影响。     

野生型及突变型乙型肝炎病毒X基因在pGEX-6P-2系统中的克隆、表达、纯化及免疫鉴定

构建野生型和A1762T/G1764A双突变型乙型肝炎病毒(HBV)X基因原核表达系统,为深入研究HBV X基因及其双突变后对HBV慢性感染者病情发展和肿瘤发生的作用奠定基础。从慢性乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因组DNA,经PCR扩增和基因测序,证实并获得野生型及A1762T∕G1764A双突变型HBV X基因。应用TA克隆及亚克隆技术将2基因分别插入pGEX-6P-2载体,构建pGEX-6P-2-hbvxw(野生型)及pGEX-6P-2-hb-vxm(A1762T∕G1764A突变型)重组表达载体;转化入宿主菌进行诱导表达;包涵体复性后,GSTrap FF蛋白纯化柱纯化带有GST标签的野生型和A1762T∕G1764A突变型HBV x抗原(HBxAg);应用SDS-PAGE、Westernblot和ELISA方法对表达的野生型和突变型HBxAg进行鉴定。结果SDS-PAGE证实本研究构建的2个表达系统均能高效表达目的蛋白;复性、纯化后野生型和突变型GST-HBxAg分别达到4.88mg/mL和5.07mg/mL;Western blot鉴定证实所纯化的野生型和突变型HBxAg均能被特异性的单克隆抗体所识别;ELISA方法检测显示2种抗原都能成功包被于微量滴定板上并与乙肝患者血清反应。证实本研究成功地构建了野生型和A1762T∕G1764A突变型HBxAg表达系统,为进一步研究A1762T∕G1764A基因突变对肿瘤发生学和慢性HBV感染者疾病进展的作用和分子机制奠定了基础。     

小麦高分子量麦谷蛋白亚基1Dx5启动子驱动外源基因的表达

将小麦高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)基因的胚乳组织特异性表达启动子驱动的外源突变型1Dx5基因和gus基因导入小麦中.对其转基因植株连续3代的跟踪研究表明,突变型1Dx5基因的重复序列导致其表达蛋白分子量增大,并影响其它1Bx17 1By18亚基基因的表达.组织化学分析观察到gus基因在1Dx5基因启动子驱动下的表达表现出胚乳组织特异性,在开花2周后开始表达,表达量呈持续上升,至腊熟期达到最高,其次为籽粒成熟期.