胰蛋白酶工程研究进展

胰蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶家族,由223个氨基酸残基组成,在胰腺泡组织中表达。牛、猪、鼠胰蛋白酶的氨基酸序列表现出广泛的同源性。     

猪胰脏细胞cDNA文库的构建

 本文以新鲜猪胰脏为材料,采用异硫氰酸胍法和寡聚(dT)-纤维素亲和层析法,提取了Poly(A)~+RNA,经麦胚无细胞体系鉴定其体外翻译活性,~3H-Leu参入量为空白对照的5倍。参照Gubler和Hoffman等人的方法,以此poly(A~+)RNA为模板,合成总cDNA,并采用多聚物加尾法,与pUC19质粒重组,转化入感受态E.coliJM107,进行分子克隆,其转化率为3.6×10~4克隆子/μgcDNA。并对重组质粒DNA进行了酶切鉴定。     

大鼠、小鼠胰蛋白酶的分离纯化及动力学性质

采用STI-Sepharose 4B亲和层析的方法,从鼠新鲜胰脏中分离得到纯的胰蛋白酶。大鼠胰蛋白酶的比活为24 615BAEEU/mg蛋白,总活性回收率47％,小鼠胰蛋白酶的比活为32 768BAEEU/mg蛋白,总活性回收率55％。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,大鼠、小鼠胰蛋白酶均呈现单一蛋白带,两者的分子量都是24kD。用等电聚焦电泳测定,二者的等电点均为p19.5以上。对它们的动力学性质作了研究,大鼠胰蛋白酶的Km值为2.33×10~(-4)mol/L,K,值为0.92×10~(-5)mol/L,小鼠胰蛋白酶的Km值为5.60×10~(-4)mol/L,K:值为1.27×10~(-5)mol/L。     

昆虫神经毒素的研究:DDT对美洲(虫非)蠊L-酪氨酸脱羧酶的诱导作用

本文选择美洲(虫非)蠊Periplaneta americana作为材料,采用放射性同位素标记及放射自显影技术,观察DDT中毒(虫非)蠊体内L-酪氨酸脱羧酶的变化,结果表明,DDT具有诱导酪氨酸脱羧酶活性的作用。用加入放线菌素-D及环己亚胺的方法,证明诱导控制在转录水平。还发现,这一诱导作用伴随着血淋巴中cAMP量的增加。根据DDT的诱导效应只在活体内发生,离体情况下不发生这种情况,以及连续的电刺激也可诱导毒素产生等现象,作者等提出DDT的物理诱导假说。     

猪胰蛋白酶自溶活性产物—绿豆胰蛋白酶抑制剂复合物的初步晶体学研究

本文报道了猪胰蛋白酶自溶活性产物——绿豆胰蛋白酶抑制剂复合物的晶体生长及晶体学参数的测定。晶体衍射分辨率为2.8A,四方晶系,空间群I422,晶胞参数为a=b=121.6A,c=113.6A,V=1.680×10~6A~3,每个结晶学不对称单位中含一个复合物分子。     

用定位突变探讨胰蛋白酶的稳定性

应用定位突变的方法,对鼠胰蛋白酶分子中易自溶位点的氨基酸残基进行改造,以探索提高胰蛋白酶稳定性的可能。将鼠胰蛋白酶原cDNA从质粒pTRAP上切下,插入载体M13mp8,在E.coli JM 101菌株中转化、复制后用以转染RZ1032缺陷型菌株,利用含U模板,进行按实验目的设计寡聚核苷酸引物引导的定位突变,将易自溶位点Ary105改造为Leu或Gly。经酶切和序列测定,证明在设计位点发生了预期的碱基突变。为了检查活性方便,又将含突变型胰蛋白酶cDNA从pTRAP上切下,插入另一个表达载体pTN中,转化入E.coli SM 138宿主中进行表达,表达产物分泌到围膜间隙,作专一性底物TAME活性胶方法检测,证明改造后的表达产物具有胰蛋白酶活性。对突变与野生型胰蛋白酶进行了初步比较。     

从一级结构预测蛋白质稳定性——Guruprasad,Reedy 和 Pandit 方法

介绍了一种从一级结构预测蛋白质稳定性的方法.Guruprasad,Reedy 和 Pa-ndit 对32种稳定蛋白质和12种不稳定蛋白质进行了统计分析,发现存在这样一些二肽,它们在稳定的和不稳定蛋白质中的出现频率是明显不同的.通过一系列的统计学计算处理,计算出所有400种二肽各自对蛋白质稳定性(或不稳定性)的影响大小,给它们设计了一个二肽不稳定性权值(DIWV).对一个给定的蛋白质,与它的序列长度相一致的这些 DIWV 的加和能帮助区分不稳定蛋白质和稳定蛋白质.这种方法对如何提高蛋白质的稳定性具有一定的指导意义.我们根据 Guruprasad 等人的方法计算了几个已知序列的蛋白质的稳定性指数,并由此推出它们的稳定性.